202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 Ennek a plazmidnak a bevezetése E. coli-ba a keletkezett törzs ampicillinre (és más ß-laktäm típusú antibiotikumokra) való rezisztenciáját eredményezi. Ezenkívül ez a plazmid hordozza a LEU2 és URA3 élesztógéneket, amelyek mind az E. coli, mind a Saccharomyces törzsekben kifejeződnek. Ennek a plazmidnak a jelenléte E. coli-ban vagy Saccharomycesben tehát lehetővé teszi, hogy a ß-izopropil-malät dehidrogenáz vagy orotidin-monofoszfát-dekarboxilázhiányos törzsek komplementációját kapjuk. A pTG881 plazmidot a következő módon alkottuk meg. A kiindulási plazmid a pTG848 volt (ez azonos a 83/15 716 számon bejelentett francia szabadalmi bejelentésben leírt pTG849-cel azzal a különbséggel, hogy az ura3 gén iránya fordított); ez a következő DNS ffagmenseket tartalmazza (7. ábra). 1. A pJDB207 plazmidból származó, mintegy 3,3 kb-s EcoRI-HindlI fragmens (17). A Hindül hely megfelel a 2 (x plazmid B formája 105. koordinátájának, az EcoRI hely pedig a 2243. koordinátának. Ebben a fragmensben a LEU2 gént a 2 p. fragmens B formája PstI helyére polidezoxi-adenilát/polidezoxi- timidilát meghosszabbítás révén iktattuk be (17). 2. Az URA3 gén Hindül fragmense (18). 3. A pBR322 nagy EcoRI (0. koordináta/-SalI (650. koordináta) fragmense. Ennek a fragmensnek a Pvuü helyébe a PGK gén végének megfelelő 510 bázispáros EcoRI-Hindlü ffagmenst (amelynek végeit előzőleg a 4 nukleotid jelenlétében Klenow-enzim segítségével tompává tettük) iktattuk be (19). Amikor ezt beiktatjuk a pBR322 Pvuü végébe, a PGK gén kivágott EcoRI helye egy EcoRI helyet regenerál. 4. A PGK gén HindlII-Sall fragmense (2,15 kb). A pTG848 plazmidot Hindlü-mal hasítottuk, és az ezáltal felszabadult két fragmens végeit tompává tettük Klenow enzimmel végzett kezeléssel a négy dezoxiribonukleotid jelenlétében. A két fragmens ligálását elvégeztük, és a transzformálás előtt ezt a ligációs keveréket Hindül tevékenységének vetettük alá, ami lehetővé teszi, hogy bármilyen plazmidból, amely HindlII helyet (vagy két ilyen helyet) tartalamaz, ezt eltávolítsuk. A BJ5183/pyrF/ E. coli törzset transzformáltuk ezzel és a transzformánsokat ampicillin-rezisztenciára és pyr+ jellemzőre szelektáltuk. A pTG874 plazmidot kaptuk ilyen módon (7. ábra), amelyben a Hindlü helyek eltűntek, és az átírást előidéző URA3 gén orientációja azonos irányú, mint a foszfoglicerát kináz (PGK) gén iránya. A pTG874 plazmidot Smal-gyel és Sall-gyel hasítottuk, és azután a 8,6 kb-s ffagmenst agaróz gélről izoláltuk. A pTG864 plazmidot, amely az MFal génnek a pBR322 azonos helyébe klónozott EcoRI-Saü fragmensét (mintegy 1,4 kb) tartalmazta, EcoRI-gyel hasítottuk. A plazmid végeit, amelyet ilyen módon linearizáltunk, tompa végűvé tettük Klenow-enzim segítségével a négy nukleotid jelenlétében. Emésztést végeztünk ezután Sáli enzimmel, és az EcoRI (tompa vég) - Saü ffagmenst, amely az MFal génnek felel meg, izoláltuk. Ez utóbbi ffagmenst a pTG874 Smal- Sall darabjával (8,6 kb) ligáljuk, ezáltal kaptuk a pTG876 plazmidot (8. ábra). Abból a célból, hogy az MFal promotor szekvencia középponthoz közelebb eső (proximális) BgUI helyét eltüntessük, a pTG876 plazmidot a Bgül-vel végzett részleges emésztés után Klenow-enzim hatásának tettük ki a négy dezoxiribonukleotid jelenlétében. A nyert plazmid, a pTG881 (9. ábra) lehetővé teszi idegen kódoló szekvenciák beiktatását az MFal gén első Hindin helye és a PGK gén végének BglII helye között. Amikor az idegen kódoló DNS Hindül helyénél a fúzió lehetővé válik olyan módon, hogy a kapott transzláció azonos leolvasó fázisban van, a kapott hibridfehérje tartalmazza a feromon prepro-részeit. A HindID-EcoRI fragmens, amely a hirudin gént hordozza, klónozása pTG881-be a pTG886 plazmidhoz vezet (10. ábra). Amikor a klónozást végrehajtottuk, a ffagmenstől „lefelé” egy BglII hely van, és ez lehetővé teszi, hogy a fragmens ismét kivonható legyen. Hinfl-BglB formában, ahol a Hinű hely azonos, mint amelyet fentebb használtunk. Mivel csupán egyetlen Bglü hely van a pTG881-ben, nagyon könnyű a hirudint kódoló szekvencia 5’ végének helyreállítása 3 oligonukleotidot alkalmazva, amely helyreállítja a hirudin 5’ szekvenciáját, és lehetővé teszi, hogy az érett hirudinszekvencia által követett a feromon prepro-szekvenciája az adott fázisban olvasható legyen. Ezt az új plazmidot pTG897-nek nevezzük (11. ábra). 3. példa. A hirudin kifejezése élesztőkkel A pTG897 DNS-ét alkalmaztuk, hogy egy TGYlsp4/MATa, ura3-251-373-328, his3-ll-15/ élesztőt ura+-szá transzformáljuk már leírt technika alkalmazásával (20). Egy transzformált telepet altenyésztésnek vetettünk alá és felhasználtuk 10 ml minimál táptalaj + 0,5 % kazaminosav (hidrolizált kazein) beoltására. A tenyésztés 20. órája után a sejteket centrifugáltuk és a felülúszót dializáltuk desztillált vízzel szemben, és bepárlással koncentráltuk (centrifugálás vákuumban). Párhuzamos eljárásban egy pTG886-tal transzformáit TGYlsp4 tenyészetet és egy hirudin szekvenciát nem hordozó plazmiddal transzformált TGYsp4 telepet (TGYlsp4/pTG856) kezeltünk hasonló módon. A száraz üledéket 50 p vízben felvettük és 20 (xl-t felforraltunk 2,8 % SDS (nátrium-dodecil-szulfát) és 100 mmól/l merkapto-etanol jelenlétében, majd akrilamid- SDS gélre (15 % akrilamid; 0,1 % SDS) vittük (21). A rögzítés és Coomassie kékkel végzett festés után olyan polipeptideket tudtunk kimutatni, amelyek a TGYsp4/pTG886 és TGYlsp4/pTG897 tenyészet felülúszókban felgyülemlettek, de amelyek nincsenek jelen a kontroll tenyészet felülúszóiban (12. ábra). Ezenkívül ezeknek a többletpeptideknek a sorozata [35S] ciszteinnel erősen jelzett, ami el is várható a hirudinpeptidektől; ez a molekula ugyanis ciszteinben nagyon gazdag (10. ábra). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
