202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202919 B 2 A 7. ábra vázlatosan bemutatja a pTG874 megalkotását. A 8. ábra vázlatosan bemutatja a pTG876 megalkotását. A 9. ábra vázlatosan bemutatja a pTG881 megalkotását. A 10. ábra vázlatosan bemutatja a pTG886 megalkotását. All. ábra vázlatosan bemutatja a pTG897 megalkotását. A 12. ábra a pTG886-tal és pTG897-tel transzformált élesztő tenyésztése után a tápközegben kapott, >1000 molekulatömegű fehérje egy akrilamidgél elektroforézisét mutatja. A 13. ábra a pTG886-tal és pTG897-tel transzformált élesztő tenyésztése után a tápközegben kapott, >1000 molekulatömegű fehérje egy akrilamidgél elektroforézisét mutatja. A 14. ábra vázlatosan bemutatja a pTG1805 megalkotását. A 15. ábra a pTG847-tel és pTG1805-tel transzformáit élesztő tenyésztése után a tápközegben kapott, >1000 molekulatömegű fehérje akrilamidgél elektroforézisét mutatja. A 16. ábra olyan diagram, amely összehasonlítja a különböző aminosavszekvenciákat az első hasítási helytől (Lys-Aig) „lefelé” különböző konstrukciókban. Az aminosav és nukleotid-szekvenciákat nem ismételjük meg a jelen leírásban, hogy ne terheljük túl a leírást, de ezek természetesen határozottan részeit képezik a leírásnak. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük. A példákban alkalmazott eljárásokat a szakterületen jártas szakemberek számára ismert módon, például a Molecular Cloning című kézikönyvben (Sambrook J., Fritsch E.F. és Maniatis T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.) ismertetett módon végeztük. Az enzimeket a gyártó előírásai szerinti körülmények között alkalmaztuk. 1. példa. A pTG822 megalkotása A hirudin HV-2 cDNS fragmensét a pTG717 plazmidnak Pstl-gyel végzett emésztése után képzett gélből kivontuk, majd egyidejűleg emésztett HinfI és Ahaül enzimekkel. A Hinfl enzim az érett hirudin HV-2 szekvencia első kodonjától „lefelé” hasít. Az Ahaül enzim a hirudin szekvencia stop kodonja (3’) mögött mintegy 30 bázispárral hasít. Az így kapott Hinfl - Ahaül fragmenst agaróz gélen izoláltuk, majd ebből a gélből eluáltuk. Az érett fehérjét kódóló szekvenciát a pTG880 vektorba vezettük be. A pTG880 vektor a pTG838 vektor egyik származéka (3. ábra). ApTG838 plazmid azonos a pTG833-mal a PGK átírási terminátorhoz közel elhelyezkedő BgID hely kivételével. Ezt a helyet Klenow polimerázzal végzett feltöltéssel eltüntettük, és így alakult ki a pTG838. A pTG833 egy élesztő/E. coli „ingázó” plazmid. Ezt a plazmidot arra tervezték, hogy idegen fehérjéket fejezzen ki élesztőben. Ennek a vektornak (3. ábra) az alapelemei a következők: az URA3 gén, mint szelekciós marker élesztőben; a 2 |i plazmid élesztő replikációs origó; az ampicillin rezisztenciához szolgáló gén; a pBR322 E. coli plazmid replikációs origója (ez a két utóbbi elem lehetővé teszi, hogy a plazmid szaporodjék és szelektálódjék E. coli bacilusban); az élesztő PGK gén 5’ szegélyező területe azzal a szekvenciával, amely ezt a gént kódolja a SaUI helyig, a pBR322 Sail - PvuII ffagmense, és a PGK gén terminátor (19). Ezt a plazmidot már leírták a 84/07,125 számú francia szabadalmi bejelentésben. A pTG880 plazmidot a pTG838-ból alkottuk meg (4. ábra) úgy , hogy egy rövid polilinker területet iktattunk be (amely az Ml3 bakteriofágból származik) EcoRI-gyel és BgUI-vel hasított pTG838-ba, amely lehetővé teszi egy sor klónozó hely elhelyezkedését (sorrendben Bglü, PstI, HindlB, BamHI, Smal és EcoRI) közvetlenül az élesztő PGK gént szegélyező 5’ terület után. A pTG880 plazmid DNS-t BgUI-vel és Smal-gyel emésztettük, és az emésztéssel képződött nagy fragmenst izoláltuk és gélről eluáltuk. A pTG717 Hinf I - Ahalü fragmensét, amely tartalmazza a hirudin HV-2-t kódoló szekvencia nagyobb részét, összekevertük az emésztett pTG880-nal, valamint egyedejűleg a hirudin szekvencia NH2 terminális területének helyreállítására szánt három szintetikus oligonukleotiddal, amely nukleotidok újra összekötik a vektor BgUI helyét a hirudint tartalmazó fragmens Hinfl helyével. Ezt a keveréket ligációs kezelésnek vetettük alá, majd ez szolgált E. coli sejtek transzformálására. A pTG882 plazmidot transzfoimánsokból nyertük ki. Ez a plazmid szolgált az élesztősejtek transzformálására, abból a célból, hogy hirudint termeljünk a PGK promotor szabályozása alatt. Az ezzel a vektorral transzformált sejtek nyers sejtextraktumaiban azonban hirudin aktivitást nem mutattunk ki. Az aktív hirudintermelés hiányának oka még nem világos. A pTG882 megalkotása azonban a hirudint kódoló szekvencia forrásaként szolgált az alábbiakban leírt élesztő kiválasztó vektorokhoz. 2. példa. A pTG886 és pTG897 megalkotása Először a hirudinszekvenciát tartalmazó pTG882 EgUI-EcoRI fragmensét (230 bp) vittük át M13mp8 bakteriofágba (6. ábra) a BamHI és ExoRI helyek közé. így kaptuk az M13TG882 fágot, amelyből egy EcoRI-HindlII fragmenst (mintegy 245 bp) lehetett izolálni. Ez a fragmens tartalmazza a hirudin HV-2 teljes kódoló szekvenciáját, a BamHI/Bglü fúziós helyet, és olyan kohezív végeket (HindüI-EcoRI), amelyek lehetővé teszik, hogy ez klónozható legyen a pTG881 élesztő kiválasztó vektorba (9. ábra). A pTG881 (10 kb) egy E. coli/élesztő „ingázó” plazmid, amely autonóm módon replikálódik mind E. coli-ban, mind Saccharomyces cerevisiae, S.uvarum és S.carlsbergiensis törzsekben. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
