202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 Számos fúziót hajtottunk végre az a-feromon gén és az érett hirudinszekvencia között. Az MATa típusú élesztőseitek ki tudják fejezni ezeket a fúziós géneket. A megfelelő hibridfehérjét azután el lehet készíteni azoknak a szignáloknak az eredményeképpen, amelyeket ezek tartalmaznak, és amelyek a feromon prekurzor prepro-szekvenciáiból erednek. Következésképpen az várható, hogy hirudinszekvenciával rendelkező polipeptidek nyerhetők ki a tenyészközeg felülúszóból. Ezeknek a konstrukcióknak egyike, az ScL szekvencia egy ATG kodont tartalmaz a H gént megelőző 3’ végnél; a fúziós fehérje ezért tartalmaz egy metionint közvetlenül az érett hirudinszekvencia első aminosavától „fölfelé”. Cianogén-bromiddal végzett hasítás után a polipeptidből olyan hirudinmolekulát kapunk, amelyet egy renaturáló lépés után aktívvá lehet tenni. Egy másik konstrukcióban az a-feromon előállításához normálisan használt hasítási szignálok szolgálnak trombinellenes aktivitással bíró polipeptidek a tenyészet felülúszójában történő előállítására. Ez az az eset, amikor az ScL szekvencia két kodont tartalmaz 3’ végénél, amelyek Lys-Aig-ot kódolnak, azaz AAA-t vagy AAG-t AGA-val vagy AGG-vel; a polipeptidet valamely olyan endopeptidázzal hasítjuk, amely a Lys- Arg dipeptidet a COOH oldalon elhasítja, ezáltal szabadítva fel a hirudint. A találmány főleg olyan konstrukciókra vonatkozik, amelyekben a hirudin gént megelőző szekvencia a következő aminosav-szekvenciák egyikét kódolja. 1. Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Val Asp Gly Ser Met hirudin 2. Lys Aig Glu Ala Glu Ala hirudin ..., 3. Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg hirudin ..., 4. Lys Arg Glu Alá Glu Ser Leu Asp Tyr Lys Arg hirudin .... vagy 5. Lys Arg hirudin ... Lehetséges természetesen előirányozni más szekvenciák alkalmazását is, amelyek aminosavszinten szelektíven hasadnak valamilyen enzimmel, azzal a feltétellel, hogy ennek a hasítási helynek nem szabad jelen lenni a hirudinen magán. Végül a kifejező szakasznak a H gén után rendelkeznie kell egy élesztő terminátor szekvenciával, pl. a PGK (foszfogliceráz-kináz) génszekvenciával. Általában a találmány szerinti kifejeződő szakaszokat vagy egy autonóm módon replikálódó plazmidban, vagy az élesztő kromoszómában lehet integrálni valamely élesztőben, főleg Saccharomycesben. Amikor a plazmid autonóm, az tartalamazzon a replikációját biztosító elemeket, azaz egy replikációs origót, pl. a 2 p. plazmid replikációs origót. Ezenkívül a plazmid tartalmazhat szelekciós elemeket, pl. URA3 vagy LEU2 gént, amelyek az ura3' vagy leu2' élesztők komplementációját szolgáltatják. Ezek a plazmidok tartalmazhatnak olyan elemeket is, amelyek a replikációjukat szolgáltatják baktériumokban, amikor a plazmidnak „ingázó” („shuttle”) plazmidnak kell lennie, pl. egy replikációs origót, mint pl. a pBR322 origója, egy marker gént, mint pl. Ampr és/vagy más elemeket, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A jelen találmány olyan élesztőtörzsekre is vonatkozik, amelyek egy jelen találmány szerinti kifejeződő szakasszal vannak transzformálva, amelyet vagy valamely plazmid hordoz, vagy a kromoszómájába van integrálódva. Ezek közül az élesztők közül leginkább a Saccharomyces nemzetség élesztőit, elsősorban a S. cerevisiae-t kell megemlítenünk. Amikor a promoter az a-feromon gén promotorja, az élesztő előnyösen MATa szex típusú. így pl. valamely ura3' vagy leu2' genotípusú törzset alkalmazunk, amely komplementálva van olyan plazmiddal, amely a plazmid fenntartását szolgáltatja az élesztőben megfelelő szelekciós kényszer alkalmazásával. Bár hirudint a fenti transzformált törzs fermentálásával, a hirudinnak a sejtben való felgyülemlésével elő lehet állítani, mégis előnyösebb, ami a fentebbi leírásból is világossá vált, ha a hirudin kiválasztását a tenyészközegbe vagy érett formában, vagy prekurzor formájában érjük el, amelyet azután in vitro kell feldolgozni. Ezt az érést számos lépésben lehet kivitelezni. Először is szükséges lehet néhány, az L*x szekvencia transzlációjából eredő elemet lehasítani, és ezt a hasítást az ScL-nek megfelelő szekvencián kell végbevinni. Amint fentebb megállapítottuk, az érett hirudint megelőzheti egy metionin, amelyet szelektíven hasítunk le cianogén-bromiddal. Ezt a módszert azért lehet alkalmazni, mert a hirudint kódoló szekvencia nem foglal magában metionin kodont. Eljárhatunk úgy is, hogy az N-terminális végnél a Lys-Arg dipeptidet alakítunk ki, amely a COOH oldalon egy specifikus endopeptidáz hatására elhasad; mivel ez az enzim aktív a kiválasztási folyamatban, ezért lehetséges ilyen módon az érett fehérjét közvetlenül megkapni a tápközegben. Bizonyos esetekben azonban szükséges lehet az enzimes hasítást a kiválasztás után fajlagos enzim hozzáadásával végezni. Bizonyos esetekben, főleg cianogén-bromiddal végzett kezelés után, szükséges lehet a fehérje renaturálása a diszulfidhidak újraképzéséhez. Ebből a célból a peptidet denaturáljuk pl. guanidinium-hidrokloriddal, majd renaturáljuk redukált és oxidált glutation jelenlétében. Végül a találmány a jelen találmány szerinti eljárással nyert hirudinra is vonatkozik. A jelen találmány szerinti eljárást az alábbi példák és ábrák segítségével mutatjuk be közelebbről. Az 1. ábra a pTG 717-ben klónozott hirudin cDNS fragmens nukleotid szekvenciáját mutatja be. A 2. ábra az alfa szex feromon prekurzor nukleotid szekvenciáját mutatja be. A 3. ábra vázlatosan bemutatja a pTG834 megalkotását. A 4. ábra vázlatosan bemutatja a pTG880 megalkotását. Az 5. ábra vázlatosan bemutatja a pTG882 megalkotását. A 6. ábra vázlatosan bemutatja az M13TG882 megalkotását. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
