202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 A találmány tárgya eljárás olyan DNS szekvenciák kifejezésére szolgáló vektorok előállítására, amelyek valamely hirudint vagy hirudin-analógot kódolnak, továbbá eljárás a hirudin kiválasztására, az ezekkel a vektorokkal transzformált élesztők segítségével. Az orvosi pióca (Hirudo medicinalis) nyálmirigyeiben jelen levő antikoaguláns aktivitás eredete a hirudinként ismert kis polipeptidre vezethető vissza (1). Ezt a fajlagos és nagyon hatásos trombin-inhibitort széles körben tanulmányozták az utóbbi időkben, mivel ez potenciálisan egy nagyon hatásos gyógyászati szer. Az izolálás és tisztítás különleges nehézségei és költségei azonban akadályt jelentenek abban, hogy ezt széles körben használják, és e miatt még az a lehetőség is kizárt, hogy klinikai szempontból tanulmányozzák. A hirudin előállításának lehetőségét a gének klónozásával és ezek kifejezésével rekombináns DNS-technikát alkalmazva már bemutatták olyan természetes piócagén klónozásával, amely hirudint kódol, és ennek kifejezésével E. coli mikroorganizmusban (84/04 755 számú francia szabadalmi bejelentés, a bejelentő cég nevében benyújtva 1984. március 27-én). Bár már lehetséges E. coliban előállítani hirudin biológiai aktivitásával rendelkező peptidet, nagyon fontos hirudint előállítani más típusú mikroorganizmusokban is. A hirudin klinikai alkalmazása megköveteli, hogy a termék nagy tisztaságú legyen. A pirogén szennyeződések eltávolítása problémákat okozhat a hirudin tisztításánál a coli-bacillus kivonatokból. Ezenkívül az E. coli-ban szintetizált hirudin intracelluláris marad, és e miatt nagy számú egyéb E. coli eredetű pepiidtől kell megtisztítani. Ezért előnyös a hirudin gént olyan élesztőkben kifejezni, amely nem termel emberekre nézve pirogén vagy toxikus anyagokat, és amely képes a fehérjéket a tenyészközegbe kiválasztani. A hirudin, mint antikoaguláns hatásmechanizmusát csak most kezdik tudni megmagyarázni. A hirudin kötődéséhez szolgáló szubsztrátum a trombin nevű proteolitikus enzim, amely a protrombin nevű zimogén formájából való aktiválás után (X faktorral aktiválva) a fibrinogént elhasítja a vérkeringésben és fibrinné alakítja, amely a vérrögök képződéséhez szükséges. Az 1:1 arányú trombin-hirudin komplex disszociációs állandója (0,8 • 10‘10) rendkívül erős asszociációt jelez ezek között a molekulák között (2). Gyakorlatilag az e két molekula által alkotott nem kovalens komplexet in vivo nem disszociálhatónak lehet tekinteni. A hirudin a trombinnak nagyon fajlagos inhibitora, sokkal nagyobb aktivitással, mint a természetes szubsztrátum, a fibrinogén. Ezenkívül szükséges, hogy más koagulációs faktorok vagy más plazmaalkotórészek is jelen legyenek. A hirudin fajlagos és nagyon jelentős antitrombin aktivitása nyilvánvalóvá teszi, hogy klinikailag is lehet alkalmazni antikoagulánsként. A hirudint nagyon jelentős mértékben tanulmányozták állatokban antikoaguláns tulajdonságaik vonatkozásában. A legrészletesebb tanulmány (3) leírja a hirudin aktivitását a vénás trombózisok, a veredény-elzáródások és a kiterjedt véredényen belüli koagulációk (DIC) megelőzésében patkányokban. A hirudint a patkányok, kutyák, nyulak és egerek nagyon tiszta formában és intravénás injekcióban beadva jól tűrik. Az LD50 érték egerekben több, mint 500 000 egység /testsúlykilogramm (azaz mintegy 60 mg/kg). Egy másik tanulmány (4) azt mutatja, hogy az egerek 1 g/kg-ig terjedő, a nyulak 10 mg/kg-ig terjedő adagokat tűrnek, akár intravénásán, akár szubkután. Egerekben az ismételt injekciók kéthetes időtartamon át nem vezetnek érzékennyé tételt mutatű reakciókat. Ezenkívül a kísérleti állatokban a hirudin gyorsan eltűnik a veséken át (a felezési idő 1 órás nagyságrendben van), még biológiailag aktív formában (3). Két további független tanulmány, amelyek közül az egyikben (5) kutyákat alkalmaztak, másik (6) pedig a hirudin aktivitását mutatja be a DIC megelőzésére patkányokban, megerősíti van Markwardt és munkatársai pozitív eredményeit. Ezek a kutatók nemrégiben hozták nyilvánosságra a természetes hirudin humán vérzéscsillapító rendszerre gyakorolt hatásainak in vivo elemzését (7). A kezelt beteg a várt biológiai hatást mutatta toxikus mellékhatások bármiféle jele nélkül. Ki tudták azt is mutatni, hogy a hirudin megakadályozza az endotoxinok által indukált DIC kialakulását sertésekben (8), és így az endotoxémiák által okozott nagyon súlyos problémák, amelyek a sertésekben jelentős elhulláshoz vezetnek, egy lehetséges megoldását jelentheti. Egy újabb közlemény (7) leírja a hirudin intravénás és szubkután beadását emberekbe. Hat önkéntest alkalmaztak 1000 AT-egység/kg egyedi hirudin-adag farmakokinetikájának és vérzéscsillapító rendszerre való hatásának kiértékelésére. Intravénásán adagolva, a hirudin felezési ideje 50 perc, és a hirudin 50 %-a aktív formában jelenik meg a vizeletben az injekciót követő 24 óra során. A koagulációs idő (in vitro mérve trombinra, tromboplasztinra és protrombinra) elnyújtása figyelhető meg a plazmában levő hirudin koncentrációjától függően, ami azt mutatja, hogy a molekula megtartja biológiai aktivitását a beteg vérkeringésében. Nem figyelhető meg változás a vérlemezkék számában, a fibrinogén-szintben vagy a fibrinolitikus rendszerben. Az intravénás injekciókhoz hasonlóan a hirudin szubkután injekcióit is jól tűrik, a kísérleti személyen mellékhatás nem jelentkezik. Allergiás reakciók esetleges megjelenésének vizsgálatára két intrakután injekciót adtak be ugyanabba a kezelt személybe 4 hetes időközökben; az érzékennyététel semmiféle jelét nem észlelték. Sőt antihirudin antitesteket sem mutatnak ki a szérumban. Ezek a tanulmányok azt sejtetik, hogy a hirudin olyan klinikai szer lehet, amely antikoagulánsként használható. Mivel a hirudin nagyon fajlagos a vér koagulációjának az előfázisára nem hat. Az antitrombinaktivitás dózisfüggő, és a hirudin hatása gyorsan reverzibilis, mivel a vesén keresztül gyorsan eltűnik. Ki lehetett azt is mutatni, hogy a hirudin sokkal hatásosabb a heparinnál a DIC kezelésében (3, 6), amint ez várható is volt annak a ténynek az ismeretében, hogy a DIC az antitrombin HI (a heparin tevékenységéhez 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
