202919. lajstromszámú szabadalom • Eljárás transzformált élesztőkben hirudin kifejezését és szekrécióját szolgáló vektorok előállítására
1 HU 202 919 B 2 szükséges kofaktor) csökkenésével és egy 4. vérlemezke-faktor, (amely nagyon hatásos heparinellenes szer) kibocsátásával jár. Egy tanulmány azt a lehetőséget mutatja be, hogy a hirudint az emberek bőre abszorbeálhatja (9), bár az eredmények ugyancsak nehezen magyarázhatók. Piócák sejtmentes nyers extraktumai kereskedelmi készítményként rendelkezésre állnak mint kenőcsök (Hirucreme, Societé Nicholas, Franciaország, Exhirud-Blutgel, Plantorgan Werke, Német Szövetségi Köztársaság), de további vizsgálatok szükségesek nagymértékben tisztított anyag nagyobb adagjaival, annak megállapítására, hogy vajon ez-e az előnyös adagolási mód. Általában az előnyös adagolási mód az intravénás és intramuszkuláris és a perkután út. Más hirudinadagolási módról is beszámoltak már, főleg az orális útról (BSM N° 3,792 M). Más komponensekkel kombinálva ez a termék alkalmazható a pikkelysömör és más, hasonló típusú bőrrendellenességek kezelésére is, amint ezt a 2 101 393 számú NSZK-beli szabadalmi közzétételi irat leírja. A hirudint ezenkívül lehet alkalmazni antikoaguláns szerként klinikai laboratóriumi vizsgálatokban és kutatási segédeszközként. Ebben az esetben a vér koagulációjának bizonyos fázisára való nagyfokú fajlagossága jelentős előnnyel jár a leggyakrabban alkalmazott antikoagulánsokkal szemben, amelyek hatása sokkal kevésbé fajlagos. Ezenkívül a hirudin nagyon hasznos lehet antikoaguláns szerként a testen kívüli vérkeringésben és a dializáló rendszerekben, ahol jelentős előnyökkel bírhat a többi antikoagulánsokkal szemben, különösen, ha aktív formában immobilizálni lehet a mesterséges vérkeringési rendszereknek a felületén. A hirudinnak a trombinhoz való kötődést aktivitása ezenkívül még lehetővé teszi a koagulációs faktorok, pl. a VIU. faktor, közvetett védelmét a tisztítás során. Végül a jelzett hirudin alkalmazása egyszerű és hatásos módszert biztosíthat a trombin- és protrombinszint mérésére. A jelzett hirudint főleg arra lehet használni, hogy észlelhetővé tegyük a rögöket a képződés folyamán, mivel a koaguláció jelensége magában foglalja a keringő protrombin átalakulását trombinná a képződés helyén; a jelzett hirudin a trombinhoz kötődik és így a rögöket észlelhetővé teszi. Lehetőség van arra is, hogy olyan gyógyszerkészítményt állítsunk elő, amely a transzformált élesztőket tartalmazza és így hirudint bocsát ki, ilyen gyógyszerkészítmény pl. az említett élesztőt tartalmazó kenőcs, amely hirudint választ ki a bőrre. Összefoglalva a fentieket, a jelen találmány szerinti hirudinnek nagyszámú lehetséges alkalmazási területe van: 1. antikoagulánsként kritikus trombózisos állapotban a megelőzésre és a meglevő trombózisok kiterjedésének megakadályozására; 2. antikoagulánsként hematómák és duzzanatok csökkentésére mikroműtétek után, amely helyzetekben gyakran élő piócákat szoktak használni; 3. antikoagulánsként testen kívüli vérkeringési rendszerekben, és antikoaguláns szerként szintetikus biológiai anyagok bevonására; 4. antikoagulánsként vérmintákon végzett klinikai vizsgálatokban, laboratóriumi kísérletekben; 5. antikoagulánsként koagulánsokra vonatkozó klinikai kutatásokban, és kísérleti eszközként; 6. lehetséges helyi alkalmazású szerként bőrön való alkalmazásban aranyér, visszerek és ödéma kezelésében; 7. komponensként pikkelysömör és más rokon rendellenességek kezelésében; 8. végül a hirudin alkalmazható trombin lekötésére a vér tárolása során és a vérszármazékok (vérlemezkék Vin. és IX. faktor) készítése során. Irányelvként elmondható, hogy a hirudint gyógyászati kompozíciókban 100-50 000 antitrombin egység/kg/nap dózisban alkalmazhatjuk. Mivel a hirudin vízben oldható, injektálható gyógyászati kompozíciók vagy más úton alkalmazható gyógyászati kompozíciók egyszerűen készíthetők, gyógyászatiig elfogadható kötő- és hordozóanyagokat alkalmazva. Végül lehetséges jelzett hirudint alkalmazni abból a célból, hogy in vitro méréseket vagy in vivo megjelenítést végezzünk, különösen a vérrögképződés észlelhetővé tételére, a jelzés lehet radioaktív jelzés vagy bármilyen enzim- vagy fluoreszcens jelzés, ahol a jelzést ismert technikákkal végezhetjük el. A hirudin előállítását a teljes állatból arra használták, hogy meghatározzák a fehérje aminosavszekvenciáját (10,11). Az ez után következő kísérletekben egy olyan gént klónoztak, amely hírvivő (messenger) RNS-ként fejeződött ki koplaltatott piócák fejében. Ez a gén egy olyan fehérjére (2. hirudinvariáns, vagy HV-2) vonatkozó információt hordoz, amelynek szekvenciája jelentősen különbözik attól, amelyet az állat teljes testében találtak (HV-l-ként ismert fehérjevariáns). Kilenc különbség van az aminosavgyökökben a HV-1 és HV-2 között, és a két NH2-terminális gyök közötti különbségek (Val-Val vagy Ile-Thr) megmagyarázhatják a nyilvánvaló ellentmondást az irodalomban a hirudin NH2-terminális végét illetően (12). Az 1. ábra a pTG 717 rekombináns plazmid DNS szekvenciáját mutatja be, amely tartalmazza: a) HV-2 mRNS-nek megfelelő cDNS- nek egy kópiáját, valamint b) a DNS szekvenciából kikövetkeztetett aminosavszekvenciát, és a c)-nél a különbséget e között és a HV-1 aminosav-szekvenciája között. Megjegyzendő, hogy a cDNS szekvencia valószínűleg nem teljes, és lehet, hogy van egy szignál szekvencia az érett fehérje kezdetétől „felfelé”. A HV-2 cDNS kifejeződése mikroorganizmusokban azt mutatja, hogy a megfelelő fehérjének van trombinellenes aktivitása. Bár az alábbi kísérleteket a HV-2 variánssal hajtottuk végre, a következőkben, hacsak másképpen nem jelezzük, a „hirudin” és a „hirudint kódoló gén” kifejezéseket úgy használjuk, hogy ezek felölelik mindkét variánst, azaz a HV-1 vagy HV-2 variánsokat, és ha5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
