202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 (3) pH-optimum és pH-stabilitás Amint a 17. ábra mutatja, az enzim pH-optimuma 4. A 18. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C hőmérsékleten különböző pH- értékeknél 30 percig pihentettük. Amint a 18. ábrából látható, az enzim 6 és 11-es pH-érték között stabil. (4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás A 19. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 60-70 °C között van. A 20. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6 értéknél különböző hőmérsékleteken 30 percig pihentettük. Amint a 20. ábrából látható, az enzim 6-os pH-értéknél 60 °C-ig stabil. (5) Inhibitorok Amint a 11. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid és az acetohidroxámsav gátolja. 11. táblázat Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%) nélkül 100,0 HgCl2 0,05 mM 2,0 Jódecetsav 10,00 mM 100,0 Adetohidroxámsav 10,00 mM 15,2 (6) Molekulatömeg Poliakrilamid-gélelektroforézissel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 110 000 dalton. Sephadex G-200-as gélszúréssel végezve a meghatározást az enzim molekulatömegét körülbelül 140 000 daltonnak találtuk. (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,7. (8) Kristályszerkezet Az enzim nehezen kristályosítható. (9) Elemanalízis Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt. (10) Km Az enzim Km-értéke 0,2 mM (pH - 4, 0,1 mólos citrátpuffer). 6. példa Az 1. példában ismertetett módon Lactobacillus ruminis PG-98-at tenyésztünk (IFO 14 632, FERM BP-1906). Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot állítunk elő, amelynek savas ureáz aktivitása 5,2 U/ml. A fenti tenyésztőfolyadékot a 2. példában ismertetett tisztítási eljárással tisztítjuk, és így olyan enzimet állítunk elő, amelynek fajlagos aktivitása 36,7 U/mg fehérje. Az aktivitás százaléka 42,8 %. A tennék enzimkémiai tulajdonságai a következők: F savas weáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspecifitás Az enzim főként a karbamidra hat és bizonyos mértékig az etil-karbamidra és a biurétre (lásd a 12. táblázatot). 12. táblázat Szubsztrát Relatív aktivitás (%) Karbamid 100,0 Allantoinsav 0,0 Biurét 26,0 Etil-karbamid 5,0 (3) pH-optimum és pH-stabilitás A 21. ábrán látható, hogy az enzim pH-optimuma 5. A 22. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C hőmérsékleten különböző pH- értékeken 30 percig pihentettük. Amint az a 22. ábrából látható, az enzim pH - 4 és 8 közötti értékeken stabil. (4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás A 23. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 55 és 60 °C között van. A 24. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint a 24. ábrából látható, az enzim pH - 6 értéknél 55 “C-ig, pH - 4 értéknél 30 “C-ig stabil. (5) Inhibitorok Amint azt a 13. ábra mutatja, az enzimet a higany(II)-klorid, a jódecetsav és az acetohidroxámsav gátolja. 13. táblázat Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%) nélkül 100,0 HgCl2 0,05 mM 0,0 Jódecetsav 10,00 mM 50,0 Acetohidroxámsav 10,00 mM 0,0 (6) Molekulatömeg Sephadex G-200 gélszúréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 150 000 dalton. (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,7. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
