202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 (8) Kristályszerkezet Az enzim nehezen kristályosítható. (9) Elemanalízis Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt. (10) Km Az enzim Km-értéke 1,2 mM (pH - 5, 0,1 mólos citrátpuffer). 7. példa Az 1. példában leírt eljárással Lactobacillus reuteri UM-12-t (IFO 14 629, FERM BP-1904) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot kapunk, amelynek savas ureáz aktivitása 3,6 U/ml. A fenti tenyésztőfolyadékot a 2. példában ismertetett tisztítási eljárással kezeljük. így olyan enzimet állítunk elő, amelynek fajlagos aktivitása 33,4 U/mg fehérje. Az aktivitási százalék 45,3 %. A tennék enzimkémiai tulajdonságai a következők: G savas ureáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspcecifitása Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékig az etil-karbamidra és biurétre (lásd a 14. táblázatot). 14. táblázat Szubsztrát Relatív aktivitás Karbamid 100,0 Allantoinsav 0,0 Biurét 7,9 Etil-karbamid 25,5 (3) pH-optimuma és pH-stabilitás A 25. ábra szerint az enzim optimális pH-ja 4. A 26. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 “C hőmérsékleten különböző pH-értékeken 30 percig pihentettük. Amint az a 26. ábrán látható, az enzim pH - 4 és 8 között stabil. (4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás A 27. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 70-75 °C között van. A 28. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 4 és pH - 6 értéknél 30 percig pihentettük. Amint a 28. ábrán látható, az enzim pH - 6-nál 75 °C-ig, pH - 4-nél pedig 65 °C-ig stabil. (5) Inhibitorok Amint az a 15. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid és az acetohidroxámsav gátolja. 15. táblázat Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%) nélkül 100,0 HgCl2 0,05 mM 0,0 Jódecetsav 10 mM 100,0 Acetohidroxámsav 10 mM 17,1 (6) Molekulatömeg Sephadex G-200-as gélszűréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 210 000 dalton. (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,8. (8) Kristályszerkezet Az enzim nehezen kristályosítható. (9) Elemanalízis A kristályosítási nehézségek miatt nem végeztünk. (10) Km Az enzim Km-értéke 1,3 mM (pH - 4, 0,1 mólos citrátpuffer). 8. példa Az 1. példában ismertetett eljárással Lactobacillus reuteri UM-18-at (IFO 14 630, FERM BP-1905) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot kapunk, amelynek savas ureáz aktivitása 4,5 U/ml. Ezt a tenyészetet a 2. példában ismertetett tisztítási eljárással tisztítjuk, és így olyan enzimet állítunk elő, amelynek fajlagos aktivitása 39,8 U/mg fehérje. Az aktivitási százalék 41,7 %. A termék enzimkémiai tulajdonságai a következők: H savas ureáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspecifitása Az enzim főként a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékig az etil-karbamidra, biurétra és allantoinsavra (lásd a 16. tázlázatot). 16. táblázat Szubsztrát Relatív aktivitás Karbamid 100,0 Allantoinsav 12,3 Biurét 82,4 Etil-karbamid 66,2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14
