202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 léssel 20 percig. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszóhoz etanolt adagolunk 80 % végkoncentrációval. Az üledéket centrifugálással gyűjtjük, és 1 mM EDTA-t és 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,05 M trisz-HCl-pufferban (pH - 7,0) oldjuk. Az oldatot Sephadex G-100-as adszorpciós oszlopra visszük (átmérő: 7,5 cm, hosszúság: 90 cm), és az eluálást ugyanezzel a pufferoldattal végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük. Az eluátumot ezután Sephadex G-200-as, ugyanezzel a pufferral kiegyenlített adszorpciós oszlopra visszük (átmérő: 4,5 cm, hosszúság: 150 cm) és az eluálást szintén ezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és egy további DEAE Sephadex CL-6B adszorpciós oszlopra visszük, az eluálást a gradiens eluálási módszerrel végezzük ugyanezzel a pufferral, amely még 0 és 0,7 M közötti nátrium-kloridot tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Az oldat fajlagos aktivitása 76,3 U/mg fehérje, az aktivitás 38,7 %-os. A termék enzimkémiai tulajdonságai a következők: D savas ureáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspecifitása Az enzim főleg a karbamidra és bizonyos mértékig a biurétra és az etil-karbamidra hat (8. táblázat). 8. táblázat Szubsztrát Relatív aktivitás (%) Karbamid 100,0 Allantoinsav 0,0 Biurét 22,0 Etil-karbamid 18,8 (3) pH-optimuma és pH-stabilitása Amint a 13. ábra mutatja, az enzim pH-optimuma 4 és 5 között van. A 14. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C hőmérsékleten különböző pH-értékeknél 30 percig pihentettük. Amint az a 14. ábrán látható, az enzim 4 és 8 közötti pH- értékeknél stabil. (4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás A 15. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 60 °C körül van. A 16. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint az a 16. ábráról látható, az enzim pH - 6-nál 60 “C-ig stabil. (5) Inhibitorok Amint a 9. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid, jódecetsav és az acetohidroxámsav gátolja. 9. táblázat Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%) nélkül 100,0 HgCh 1 mM 0,0 Jódecetsav 10 mM 0,6 Acetohidroxámsav 10 mM 19,2 (6) Molekulatömeg Poliakrilamid-gélelektroforézissel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 160 000 dalton. Sephadex G-200-as gélszűréssel az enzim molekulatömegét 240 000 daltonnak találtuk. (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,6 körül van. (8) Kristályszerkezet Az enzim nehezen kristályosítható. (9) Elemanalízis Nem végeztük el a kristályosítási nehézségek miatt. (10) Km Az enzim Km-értéke 0,3 mM (pH - 4-nél, 0,1 mólos citrátpufferral). 5. példa A 3. példában ismertetett eljárással Streptococcus salivarius PG-303W-1 (IFO 14 746, FERM BP-1856) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter tenyésztőfolyadékot kapunk, amelynek aktivitása 4,3 U/ml. A fenti tenyésztőfolyadékot a 4. példában ismertetett tisztítási eljárásnak vetjük alá, és így egy 68,2 U/mg fehérje fajlagos aktivitású enzimet kapunk. Az aktivitási százalék 41,2 %. A tennék enzimkémiai tulajdonságai a következők: E savas ureáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspecifitása Az enzim főleg a karbamidra hat, valamint bizonyos mértékben a biurétre és az allantoinsavra (lásd a 10. táblázatot). 10. táblázat Szubsztrát Relatív aktivitás (%) Karbamid 100,0 Allantoinsav 12,0 Biurét 60,0 Etil-karbamid 50,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
