202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 üveggyöngyöt, és a sejtszuszpenziót mechanikusan szétbontjuk 4100 ford/perccel 20 percig kezelve. A szétbontott sejtszuszpenziót centrifugáljuk és etanolt adunk a felülúszóhoz 80 %-os végkoncentrációig. Az üledéket centrifugálással gyűjtjük össze és 0,05 M trisz-HCl-pufferban (pH « 7,0), amely 1 mM EDTA-t és 2-merkapto-etanolt is tartalmaz, oldjuk. Az oldatot Sephadex G-100-as adszorpciós oszlopra visszük (átmérő: 7,5 cm, hosszúság: 90 cm), és az eluálást ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük. Ezt az eluátumot azonos pufferral kiegyenlített Sephadex G-200-as adszorpciós oszlopra visszük (átmérő: 4,5 cm, hosszúság: 150 cm), és az eluálást ugyanezzel a pufferral végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, és egy további DEAE- Sephadex CL-6B adszorpciós oszlopra visszük, az eluálást gradiens eluálási módszerrel végezzük ugyanezzel a pufferoldattal, amely 0 és 0,7 M közötti nátriuim-kloridot tartalmaz. Az aktív frakciókat egyesítjük. Az oldatot ultraszűrővel koncentráljuk, Amicon 8200 UK-50-es membránt alkalmazunk (molekulatömeg leválasztóképessége 50 000 daltonnái). A puffert ekkor egy 1 mmól 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,005 M foszfátpufferral váltjuk fel (pH - 7,0). Ezután az oldatot affinitásgélkromatográfiás oszlopra visszük (átmérő: 4 cm, hosszúság: 50 cm), amelyet Affiprep 10-zel (a Bio- Rad cég terméke) és adszorpciós célú hidroxi-karbamiddal készítettünk el. Gradiens-eluálást végzünk 0,005 M és 0,044 M közötti foszfátpufferral. Az aktív frakciókat egyesítjük, és a fent említett ultraszűrővel töményítjük. Ezután frakcionális kicsapást végzünk, és a terméket liofilizáljuk. így 104 mg tisztított enzimport kapunk. Ennek a pornak a fajlagos aktivitása 124 U/mg fehérje. Az így előállított liofilizált savas enzim enzimkémiai és fizikokémiai tulajdonságai a következők: C savas ureáz (1) Hatása Az enzim 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel. (2) Szubsztrátspecifitása Az enzim a karbamidra hat (6. táblázat) 6. táblázat Szubsztrát Relatív aktivitás (%) Karbamid 100,0 Allantoinsav 0,0 Biurét 0,0 Etil-karbamid 0,0 (3) pH-optimuma és pH-stabilitása Amint az a 9, ábrán látható, az enzim pH-optimuma 5 körül van. A 10. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C-on különböző pH-értékeknél 30 percig pihentettük. Amint az a 10. ábrából látható, az enzim 6 és 10 közötti pH-értéknél stabil. (4) Hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása Amint az a 11. ábrán látható, az enzim hőmérséklet-optimuma 60-70 °C között van. A 12. ábra mutatja a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 6-nál és különböző hőmérsékleteken 30 percig pihentettük. Amint az a 12. ábrából látható, az enzim pH - 6-nál 50 °C-ig stabil. (5) Inhibitorok Amint a 7. táblázat mutatja, az enzimet a higany(II)klorid és az acetohidroxámsav gátolja. 7. táblázat Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%) nélkül 100,0 HgCh 1 mM 0,0 Jódecetsav 10 mM 89,8 Acetohidroxámsav 10 mM 9,8 (6) Molekulatömeg A poliakrilamid-gélelektroforézises módszerrel az enzim molekulatömege mintegy 190 000 dalton [lásd H. Eng et all; Can. J. Microbial., 32, 487 (1986)]. Sephadex G-200-as gélszűréssel az enzim molekulatömegét mintegy 170 000 daltonnak találtuk. (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja mintegy 4,7. (8) Kristályszerkezet Az enzim nehezen kristályosítható. (9) Elemanalízis Nem végeztük a kristályosodási nehézségek miatt. (10) Km Az enzim Km-értéke 0,2 mM (pH - 5,0, 0,1 mólos citrátpuffer). 4. példa A 3. példában ismertetett eljárással Streptococcus mitior PG-154-et (IFO 14 633, FERM BP-1448) tenyésztünk. Az eljárással 10 liter baktériumtenyésztő folyadékot készítünk, amelynek aktivitása 5,4 U/ml. Az így előállított tenyésztőfolyadékot centrifugálva nyeljük ki a sejteket, amelyeket kétszer 0,05 M foszfátpufferral mosunk (pH - 7,2), majd 4 liter 0,05 M foszfátpuffert (pH - 7,2) 1 mM EDTA-t és 1 mM ditio-treitolt tartalmazó oldatban szuszpendálunk. Ezután a sejtszuszpenzióhoz hozzáadunk 2 liter 0,1 és 0,2 mm közötti átmérőjű üveggyöngyöt, és mechanikus szétbontásnak vetjük alá 4500 fordulat/perc keze5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
