202885. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proburzin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 885 B 2 A találmány szerinti eljárással tehát egy újonnan izolált emlős polipeptidet, az ún. proburzint állítjuk elő, amelynek aminosavszekvenciája: (1) (5) (10) (14) Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg A proburzin 14 aminosavból álló szekvenciájának első öt aminosavmaradéka megegyezik a szomatosztatin hormon aktív helyének szekvenciájával. A proburzin 5-8. aminosavmaradékai megegyeznek a humán tuftszin peptid aktív helyével. Emellett a proburzin 9-11. aminosavmaradéka megegyezik a fent említett burzin pepiiddel. A proburzin szekvenciájában jelenlevő ezen átlapoló szomatosztatin, tuftszin és burzin szekvenciák azonosak a szomatosztatin, tuftszin és burzin aktív helyéinek humán szekvenciáival. így, bár a proburzin polipeptidet először borjúembriómájból izolálták, feltételezhető, hogy a szekvenciája lényegében véve azonos más emlősökben is, különösen emberekben. A találmány szerinti eljárással tehát emlős proburzint, illetve annak analógját állítjuk elő lényegében véve natív, fehérjeeredető anyagtól mentesen, azaz emlős májból vagy csontvelőből izolálva, vagy szintetikusan vagy rekombináns úton előállítva. A proburzin változatokat, beleértve a természetben előforduló alléi változatokat a szekvenciában az emlős fajoktól és az egyes fajok egyes tagjaitól függően, valamint beleértve a szekvenciákba beiktatott esetleges változtatásokat, mint például mutagén vagy kémiai úton végzett változtatásokat, vagy a különböző rekombináns gazdaszervezetek alkalmazása következtében fellépő változásokat, mint például glikozilezési változásokat, vagy az egyébként idegen molekulák kapcsolását, mint például radioaktív jelzéseket, a kővetkezőkben általánosságban proburzin analógként említjük. Ezek az analógok szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. Az emlős proburzin előnyösen humán proburzin. A proburzint először szarvasmarhaembriómájból izolálták a burzin elleni antitest segítségével, amelyet a tisztaság ellenőrzésére alkalmaztak. A proburzin izolálásának eljárását az 1. példában mutatjuk be. Az emlős proburzin előnyösen májból izolálható, izolálható azonban csontvelőből is az 1. példában a szarvasmarhamájból történő izolálásra bemutatott módszerhez hasonlóan. A proburzin a fent bemutatott polipeptid szekvenciával rendelkezik, lehetséges azonban a szekvencia alléi változata is, valamint olyan szekvenciaváltozat, amely az izolálásra használt emlősforrás natív anyagának megfelelő további aminosavakat tartalmaz. A proburzin 14 aminosavas szekvenciáját kémiai úton is szintetizálhatjuk, így egy új szintetikus pepiidet kapunk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint egy olyan szintetikus pepiidet állítunk elő, amelynek képlete: Phe-Phe-Trp-Lys-Thr- Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg, a találmány tárgykörébe tartozik továbbá a peptid farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóinak előállítása is. A proburzin polipeptid savaddíciós sójának előállítására a szabad polipeptidet alkalmas mennyiségű savval kezeljük. A találmány szerinti eljárással előállított peptid savaddíciós sóinak előállításához alkalmas savak például nem-korlátozó jelleggel a szervetlen savak, mint például a sósav, hidrogén-bromid, perklórsav, salétromsav, tiociánsav, kénsav, szénsav, foszforsav, stb. Erre a célra alkalmasak továbbá a szerves savak, mint például a hangyasav, ecetsav, propionsav, glikolsav, tejsav, szőlősav, oxálsav, malonsav, borostyánkősav, maleinsav, fumársav, antranilsav, cinnaminsav, naftalinszulfonsav, szulfonilsav, stb. A polipeptid szintetikus előállítása a Merrifield által J.A.C.S. 85:2149-2154 (1963) irodalmi helyen ismertetett szilárd fázisú szintetikus módszerrel történhet. Ez a módszer peptidek előállításának szokásos, jól ismert módszere. Peptidek szintézisének másik módszerét ismertették Bodanszky és munkatársai a „Peptide Synthesis”, második kiadás, John Wiley and Sons, 1976, helyen. A szilárd fázisú szintézis során a növekedő peptidlánchoz lépésenként adjuk hozzá a védő aminosavakat, ahol a növekedő peptidlánc kovalens kötésekkel egy szilárd gyantához van kapcsolva. Az eljárásban a reagenseket és melléktermékeket szűréssel eltávolítjuk, így az intermediereket nem szükséges tisztítani. A módszer általános koncepciója az első aminosavnak a szilárd polimerhez kovalens kötéssel történő kapcsolásától függ. A további védett aminosavakat egyenként, vagy blokkokba kapcsolva, lépésenként adagoljuk, míg a kívánt szekvencia el nem készül. Végül a védett pepiidet eltávolítjuk a szilárd gyantáról, és a védőcsoportokat lehasítjuk. A találmány szerinti eljárás során új peptid-gyanta intermediereket állítunk elő, amelyeknek általános képlete: R'-Phe-Phe-(R2)Trp-(R3)Lys-(R»)Thr-(R3)Lys-Pro-(R6)Arg-(R7)Lys-(R8)His-Gly-Gly(R9)Arg-(RI0)Arggyanta, ahol R'-R10 jelentése az illető aminosavhoz alkalmas helyen kapcsolódó védőcsoport és a gyanta egy alkalmas szilárd fázisú polimert jelent, amely a reakció során hordozóként szerepel. A peptidszintézisben járatos szakember meg tudja választani az alkalmas aminovédőcsoportokat, hidroxil-védőcsoportokat, indolvédőcsoportokat, imidazolvédőcsoportokat és a gyantát, például a fent említett irodalmi helyek alapján. Szakember szintén képes az említett peptid-gyanta intermedierekhez hasonlóakat előállítani. Az aminosavak bármely alkalmas polimerhez kapcsolhatók. A gyantának olyan funkcionális csoportokat kell tartalmaznia, amelyekhez az első védett sminosav kovalens kötéssel szorosan kapcsolható. Erre a célra különböző polimerek vagy kopolimerek alkalmasak, mint például a cellulóz, polivinil-alkohol, polimetilmetakrilát, polisztirol és polisztirol-divinil-benzol. A szintézis során hasznosítható védőcsoportok felsorolása megtalálható a fent említett irodalmi helyeken, valamint J.EW. McOmie, „Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, New York, 1973 irodalmi helyen. A találmány szerinti eljárásban előnyösen a szokásos védőcsoportokat alkalmazzuk így a tere- butoxi-karbonil- (BOC), benzil- (BZL), terc-amil-oxikarbonil- (AOC), tozil- (TOS), o-bróm-fenil-metoxi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
