202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 Az ezen eljárások szerint kapott interferonoknak csaknem kvantitatív formában monomer interferont kell tartalmazniuk; immunogenitási vizsgálatok azonban nem állnak rendelkezésünkre. Beható saját analitikai vizsgáltok azt mutatták, hogy rekombinánsan előállított ct-interferonok esetében változó koncentrációban jelenlevő különböző interferonformák elegyéről van szó. Ide számítanak az interferon oligomerei, tetramerei, trimerei és dimerei, metionin-interferon, az interferon redukált formái és töredékei és meglepő módon az interferon különböző monomer formái is. Az oligomerek esetében 70000 feletti molekulatömegű a-interferonokról, a redukált a-interferonok esetében a szabad SH-csoportokat tartalmazó proteinről és a metionin-interferon esetében olyan a-interferonról van szó, amely az N-terminális végen (feltételezhetően az a-interferon mikrobiológiai előállítása folytán) még egy metionint tartalmaz. Az analízis azt mutatta, hogy a különböző monomer formák az a-interferon különböző S-S-izomerei. Azért, hogy ezeket az izomereket nyelvileg megkülönböztessük, a következőkben a nem-natív monomer kifejezést a főként előforduló a-interferon-monomer izomereire használjuk, és ezt natív monomer «-interferonnak nevezzük. Ez azonban nem zárja ki, hogy a nem-natív monomerek „természetes” anyagban szintén előfordulhatnak. Egy a-interferon előállítására szolgáló E. coli fermentlében például legalább 7 különböző interferonkomponens (K1-K7) kimutatható. Az analízis azt mutatta, hogy oligomerekről, di-/trimerekről, metionin-interferonról, redukált interferonokról és a natív-monomer a-interferon egy olyan SS-izomeréről van szó, amely az 1 és 98 és a 29 és 138 helyzetű aminosavak között egy-egy diszulfidhidat tartalmaz [lásd még Wetzel et al., J. Interferon Res., Vol. 1, No. 3, 381-391 (1981)]. Mint már előbb kifejtettük, a rekombináns a-interferon immunogenitásának oka nem ismeretes. Nyilvánvaló azonban az is, hogy az a-interferon minden olyan formája, amely a testjellemzőtől különbözik, immunogénként hat Ilyennek számítanak a kismolekulájúak, a dimerek és oligomerek is és azok a nem-natív monomerek is, amelyek másképp kapcsolódó diszulfidhidakat tartalmaznak. Amíg az immunogenitás okai nincsenek tisztázva, rekombináns a-interferonok előállítására szolgáló eljárásoknál olyan körülményeket nem szabad alkalmazni, amelyek ezeknek a kihatásaikban ismeretlen formáknak a képződését elősegíthetik. Ez azt jelenti, hogy az interferon tisztítását is a legkíméletesebb, a natívitást nem károsító körülmények között kell végezni. Magasabb hőmérséklet és redukálószerek nem számítanak ilyen körülményeknek. Magától értetődően minden tisztítási lépésnél szavatolni kell, hogy semmilyen idegen anyagot be ne vigyünk, például a fémkelátgyanták vagy hasonló problematikus reagensek használatakor. A találmány tárgya rekombináns a-interferonok előállítására szolgáló eljárás, amelyre a főigénypontban felsorolt ismérvek a jellemzők. Az eljárás alkalmas különböző fajokból származó a-interferonok, például emberi vagy állati interferonok előállítására és tisztítására. Az előállításhoz használt mikroorganizmus lehet valamilyen prokariota vagy eukariota, például E. coli, Saccharomyces cerevisiae, előnyösen E. coli. A legkülönbözőbb gazdaszervezetek számára alkalmas tenyésztési körülmények a szakember által legjobban ismertek. Meglepőmódon arra a felismerésre jutottunk, hogy a növekedési idő nemcsak befolyással van az a-interferon- kitermelésre, hanem mindenekelőtt döntően felelős azért is, hogy milyen az interferonelegy összetétele. így például az interferonelegy összetétele az E. coli alkalmazásakor a metionin- interferon mennyiségére vonatkozólag a növekedés időtartama szerint változik. Előnyösebb ezért a fermentlevet rövid időközökben a gazdaszervezet által termelt a-interferonszármazékok képződésére, mint a legjobb növekedési idő indikátorára, megvizsgálni. A legjobb időben, például 20%-nál kevesebb, előnyösen 5%-nál kevesebb, különösen előnyösen 1%-nál kevesebb metionin- interferon képződése után már különösen tiszta interferont kapunk, amely ideális tulajdonságokkal rendelkezik az ezt követő találmány szerinti tisztítási eljáráshoz. Különösen alkalmas az eljárás savval szemben ellenálló a-interferon előállítására. Ehhez kapcsolódva alkalmazható például a 34 32 196.9 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerinti eljárás, amelynek során a sejteket 2 pH-n egy homogenizátorban tárják fel. Tandem kromatográfia, azaz különböző adszorbenseken alkalmas mosó- és eluáló oldatokkal végzett egymás után kapcsolt kromatográfiás lépések alkalmazásával meglepő módon a szennyezések nagyrésze elválasztható. Ennek során előnyösen egy affmitási oszloppal közvetlenül összekapcsolt cellulóz- előoszlopból álló kombinációt használunk. Különösen előnyös DE- 52-Zellulose valamilyen hordozóra, például Sepharose-ra kötött monoklonális antí-interferon IGG-antitesttel, például a 33 06 060 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratban leírt EBI 1 antitesttel. Alkalmas mosóoldat például valamilyen 7*5 pH-jú TRIS/NaG-puffer, de megfelelők olyan mosóoldatok is, amelyek nem befolyásolják az interferonnak az antitestekhez való kötődését, viszont kimossák a szenynyezéseket, és azokat az alkotórészeket, amelyek az antitest-oszlop tulajdonságait negatívan befolyásolják, az előoszlophoz kötve hagyják. Az interferon számára alkalmas eluálószer például 0,1 mólos citromsavoldat 25%-os etilén-glikolban, azonban más olyan eluálószerek is megfelelők,^ amelyek hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek. Általában az eluálószert a mindenkori tisztítandó «-interferonhoz kell illeszteni. A tandem-kromatográfiához nem okvetlenül szükséges trisz-puffert, illetve etilén-glikolos citromsavol-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
