202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 datot használni. A szennyezések elválasztása szempontjából csak az a döntő, hogy körülbelül azonos ionerősségű és körülbelül azonos pH-jú legyen a puffer, így használható például 0,2 mol/liter nátrium-kloridot tartalmazó 20 mmólos foszfátpuffer is, amelynek pH- ja 7,5. Az interferon eluálásakor arra kell ügyelni, hogy a pH eléggé alacsony (3 vagy az alatti) legyen. Ezért használható 0,1 mólos citromsavoldat is etilénglikol nélkül, vagy akár ecetsav is. Az etilén-glikol arra szolgál, hogy az interferon viszonylag éles csúcsként eluálódjon. A „tandem-eluátom” szennyezéseinek egy része meglepő módon már a pH-érték 4,0-4,8-ra, különösen előnyösen 4,5 pH-ra való lepufferolásával leválasztható. A pH-értéket úgy kell megválasztani, hogy a csapadékban lehetőleg kevés monomer a-interferon legyen. Az interferon végső tisztítása valamilyen kationcserélőn végzett kromatográfiával, előnyösen egy MONOS, Typ HP 10/10 kationcserélővei történik. A nagy tisztaságú a-interferon eluálására valamilyen illékony pufferral, például valamilyen ammónium-acetát pufferral kivitelezett lineáris lépcsős gradienst használunk, amelynél a pH-érték állandó és a koncentráció változik (koncentráció-gradiens). Éppilyen jó az is, ha a koncentrációt állandónak tartjuk, és a pH-t változtatjuk (pH-gradiens). Döntő, hogy az eluálószer képes legyen arra, hogy interferonszennyezéseket, különösen a főként előforduló monomer S-S-izomereit elválassza. Különösen alkalmas erre a célra egy 0,1-1,0 mólos, előnyösen 0,1-0,5 mólos ammónium-acetát oldatból 4,0-5,0 pH- tartományban, előnyösen 4,5 pH-nál előállított ammónium-acetát puffer lineáris koncentrációgradiense. Ez a puffer liofilizálással eltávolítható, úgy, hogy a nagytisztaságú a-interferonok első ízben szilárd formában, puffersóktól és lecsapószerektől mentesen kaphatók. A végső tisztításnál illékony puffert tulajdonképpen azért használunk, hogy az ezt követő liofilizálással tökéletesen eltávolítható legyen. Tulajdonképpen használható az elúcióhoz bármely szokásos 4,5-5,0 pH-jú puffer, ha a puffersókat az eluálás után ecetsavval szemben végzett dialízissel el tudjuk távolítani. Az eluáláshoz szükséges gradiens valamilyen semleges só, például nátrium-klorid hozzákeverésével, vagy mint az ammónium-acetát puffer esetében, ugyanazon puffer töményebb oldatának hozzákeverésével állítható be. Különösen alkalmas a találmány szerinti eljárás különböző fajok olyan a-interferonjainak előállítására, amelyek alkalmazás után a megfelelő fajokban semmilyen antitestet nem stimulálnak. Különösen előnyösnek bizonyult a találmány szerinti eljárás egy olyan rekombináns, homogén, tiszta, szilárd és nem-immunogén a-interferon előállításánál, amely mentes az interferon redukált formáitól és töredékeitől, amely 0,2%-nál kevesebb oligomert és 2%nál kevesebb dimer/trimer/tetramert és 5%-nál kevesebb metionin-interferont tartalmaz, és amelynek esetében a monomer-tartalom több, mint 90%-a natívmonomer-a-interferon. Különösen előnyösen alkalmazható a találmány szerinti eljárás az előbbiekben leírtakhoz hasonló olyan a-interferon előállítására, amelynél a gazdaszervezet a 5 10 15 20 25 30 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gin Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu aminosavszekvencia szerinti humán-a-interferont kódoló gént tartalmazza, és a natív monomer a-interferon egy-egy diszulfidhidat tartalmaz az 1 és 98 és a 29 és 138 helyzetekben lévő ciszteinek között. A jelen találmány tárgyát képezik azok a rekombináns a-interferonok is, amelyek a találmány szerinti eljárással előállíthatók, előnyösen homogén, tiszta formában lévő rekombináns a-interferonok, amelyek 20%-nál kevesebb, előnyösen 5%-nál kevesebb, különösen előnyösen 1%-nál kevesebb metionin-interferont tartalmaznak. A gazdaszervezet megválasztásától és fermentációs körülményektől függően az előállított rekombináns ainterferonok a metionin-interferon mellett változó mennyiségben a főtermékként előforduló monomer ainterferon di-, tri-, tetra- és oligomereit, redukált formáit és töredékeit és S-S-izomereit is tartalmazhatják, amelyek - amint leírtuk - a találmány szerinti eljárással elsőként szoríthatók háttérbe illetve küszöbölhetők ki. A találmány tárgyát képezik továbbá a homogén, tiszta formában lévő i-ekombináns a-interferonok, amelyek 20%-nál kevesebb, előnyösen 5%-nál kevesebb, különösen előnyösen 1%-nál kevesebb metionininterferont tartalmaznak, mentesek az a-interferon redukált formáitól és töredékeitől, 0,2%-nál kevesebb oligomert és 2%-nál kevesebb dimer/trimer/tetramert tartalmaznak, előnyösen nem tartalmaznak oligo-, tetra-, tri- és dimereket, előnyösen 90%-nál több natív monomert tartalmaznak, és előnyösen teljesen mentesek a natív-monomer a-interferon S-S-izomereitől. 50 55 60 4
