202709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herbicid szerekkel szemben rezisztens kultúrnövények előállítására és védelmére
HU 202709B 5 6 1. táblázat: Módosított MS-tápközeg (A) és módosított N6-tápközeg (B) összetétele Vegyület Komponensek koncentrációja (mg/1) A B MgSo4.7H20 370 250 CaCl2.2H20 440 166 KNO3 1900 2830 (NH4)2SC>4-434 NH4NO3 1650-KH2PO4 170 400 MnSC>4 22,3 22,3 KI 0,86 0,86 COCI2.6H2O 0,025 0,025 ZnS04.7H2 8,6 8,6 CuS04.5H20 0,025 0,025 H3BO3 6,2 6,2 Na2Mo04.2H20 0,25 0,25 EDTA 37,3 37,3 FeS04.7H20 27,3 27,3 tiamin.HCl 0,5 0,5 nikotinsav 0,2 0,2 ciano-kobolamin 0,1 0,1 piridoxin.HCl 0,2 0,2 p-amino-benzoesav 0,05 0,05 Ca-pantotenát 0,1 0,1 biotin 0,1 0,1 folsav 0,05 0,05 kolin-HCl 0,1 0,1 riboflacin 0,05 0,05 inozit 100 100 szacharóz 30000 30000 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav vagy 1 1 3,6-diklór-ort-ánizssav 2 2 Az 1. példa a) lépésében leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az aminosavmentes tápközegeket a következő szerves savakkal egészítjük ki: 40 200 mg/1 citromsav, 150 mg/1 a-keto-glutásav, 130 mg/1 almasav, 13mg/loxálacetát 120 mg/1 borostyánkősav 45 90 mg/1 piroszőlősav. A szerves savakat tartalmazó törzsoldat pH-ját a tápközeghez való hozzáadás előtt ammónia-oldattal 5,8-ra állítjuk be. 50 2. In vitro mutagenezis Aminosavmentes tápközegben növekedni képes, morfogén kukorica-kallusz-darabot 0,1-1% etilénmetánszulfonátot tartalmazó B tápközegben 10- 120 percen keresztül inkubálunk, a fenti tápközeg- 55 gél háromszor 10 percen át mossuk, majd A vagy B tápközegbe helyezve tenyésztjük. A túlélő, morfogén kalluszrétegeket 2-4 hét múlva friss tápközegbe átoltjuk. Újabb 2-4 hét múlva kiválasztjuk a szelekciós kísérletre alkalmas kalluszokat. 60 3. Herbicid-rezisztens kalluszkultúrák szelektálása A szelektálásra az 1. példa b) lépésében ismertetett A vagy B aminosavmentes tápközeget használ- 65 juk, és a herbicidet olyan koncentrációban alkalmazzuk, amely koncentrációnál a kalluszok 95- 99%-a elpusztul. Aglufozinát ésa dimetil-foszfinilhidroxi-ecetsav esetén ez a koncentráció 2 x 10~3 4 mól/1. A herbicidet tartalmazó 0,8%-os agar-tápközegre minden esetben 10000 kalluszt oltunk, és 6-8 hét múlva kiértékeljük a lemezeket. A Petri-csészéket naponta 12 órán keresztül 1000-2000 luxod fénynyel megvilágítjuk, és 25 °C-on inkubáljuk. A glufozinátot tartalmazó tápközegen 12 olyan kallusz képződik, amely sötétzöld primordia-sarjak kialakulása közben növekedik. A dimetil-foszfinil-hidroxi-ecetsavat tartalmazó tápközegen 3 ilyen kalluszt kapunk. A rezisztens, morf ogén kalluszok ismételt átoltásával olyan sejtvonalat kapunk, amely 5 mmól/1 herbicid-koncentrációt képes elviselni, és ugyanakkor növény-regenerálódásra is képes. 4.Növény regenerálása A kapott embriogén, herbicid-rezisztens kalluszokat regeneráló tápközegben (2,4-diklór-fenoxiecetsav vagy dicamba nélküli A vagy B tápközegben) tenyésztve 3-5 héten, általában 3-4 héten belül differenciálódik a teljes növény. Amikor a levelek az 1-3 cm-es hosszúságot elérik, a növényt az agárról ásványi tenyésztő-szubsztrátra (vermikulit, 4
