202653. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai készlet és eljárás véralvadás XIII-as faktorának meghatározására
3 HU 202 653 A 4 A fentiek alapján a találmány egy új diagnosztikai készlet vérplazma véralvadás XIII-as faktorának (FXIII enzim) meghatározására, az UV-kinetikus teszt reagenseinek felhasználásával, amely az aktivált FXIII enzim glutamin-szubsztrátjaként dcfoszforilält-szukcinil-ß- 5 -kazeint, valamint a vakreagensként etilénglikol-bisz-(ß-am inoetil -c ter)-N ,N,N\N ’ - tetraecetsavat tartalmaz. A találmány tárgya továbbá eljárás vérplazma véralvadás XIII-as faktorának (FXIII enzimnek) meghatáro- 10 zására, az FXIII enzim Ca2*-ionok jelenlétében végzett trombin aktivációja, az aktív enzim kazein-származékkal való reagál tatása, a felszabadult ammónia glutamát-dehidrogenáz által katalizált indikátorreakciója útján olyan módon, hogy aktív FXIII-enzimet defoszforilált- 15 -szukcinil-ß-kazeinnel reagáltatjuk, vakreagensként eti- 16nglikol-bisz-(ß-aminoetil-0ter)-NJ4,N’,N’-tetraecetsavat használunk. A találmány egy előnyös kivitelezési módja szerint a kiindulási anyagként használt kazein-elegyet foszfatáz- 20 enzimmel dializáljuk puffer-oldattal szemben. Ezután kálcium-klorid-oldattal kezeljük, inkubáljuk. Az eljárás igen jelentős előnyt mutat az eddig ismert elválasztási technikákkal szemben. Ismert ugyanis, hogy a tej fő fehérje-komponensét jelentő kazeinek 25 elválasztása meglehetősen nehéz, mivel molekulatömegük, fizikai és kémiai tulajdonságaik csak kismértékben térnek el. Az egyes komponensek tisztítására DEAE- cellulózon történő ioncserés kromatografálást használtak korábban. A megfelelő elválasztáshoz a puffemek 30 legalább 4,5 M-osnak kellett lennie karbamidra, kis átfolyási sebességgel és viszonylag kevés fehérjének az oszlopra vitelével kellett dolgozni. Az adott kazeinre tiszta frakciókból a karbamid dialízissel volt eltávolítható. így az eddig ismert módszer 1-2 g ß-kazein tisz- 35 tításához 5-6 x 24 óra, valamint több tíz liter puffer-, illetve desztillált víz volt szükséges. Ezzel szemben találmányunk szerinti eljárás egyszerűbb technikát, rövid technológiai átfutási időt biztosít Ugyancsak kedvezőnek és előnyösnek ítélhető talál- 40 mányunk szerinti vérplazma véralvadás XIII-as faktorának meghatározási metodikája is, mivel az általunk alkalmazott DSZ-ß-kazein gyorsan és kvantitatíve reagál, valamint a vakreagensként használt EGTA az enzim működéséhez szükséges Ca2+-t viszi komplexbe. Az ál- 45 tálunk alkalmazod EGTA-t egyébként a drága és nehezen tisztítható hirudin helyed használjuk. A továbbiakban a találmányt úgy mutatjuk be, hogy részletes példában ismertetjük a DSZ-ß-kazein előállítását a felhasználásával készített diagnosztikai készletet 50 és annak alkalmazását. Példa I. DSZ-ß-kazein-reagens előállítása 1 g Hammarsten-kazeint oldunk 25 ml 0,1M Tris- 55 -HC1 (pH = 8.0), 10 pM ZnCl2, 100 pm MgCl2 oldatában. 1 mg alkalikus foszfatáz-enzimet adunk hozzá (> 1000 E/mg protein) és dializáljuk 3 x 0,4 1 fenti pufferrel szemben 40 órán keresztül 44 °C-on. 10 térfogatnyi elegyhez 1 térfogat 0,5M CaCl2-ot adunk és 30 60 perc +4 ”C-on történő inkubáció után centrifugáljuk 20.000 g-vel +4 ‘C-on 20 percig. 6 térfogat felülúszóhoz 6 térfogat 9M karbamid, 1 térfogat piridin, majd két részletben 1-1 térfogat szukcinildiklorid-oldatot adunk. Vízzel szemben karbamid-mentesre dializáljuk és liofilizáljuk. Kapod termék: 0,85 g DSZ-ß-kazein Főbb adatai: A £5, = 4,7 ± OÁ 40 mg/ml oldatban 20 perc alad 20 mM CaCl2 hatására AA S20 nm <0,01 II. Javítod UV-kinetikus teszt FXIII meghatározására (Alkalmas 10 x 2 FXIII meghatározásra) 1 .Elve: I. Fibrinogénmentesítés bentonitos kezeléssel II. FXIII aktiváció trombin FXin------------► FXIIIa + aktivációs peptid Ca2+ III. Az FXIIIa aktivitásának mérése: O H20 II FXIIIa CHrCHr-NH^HiN-C-DSZ-ß-kazein ------------► Ca2t HO I II CH3-CHr-N-C-DSZ-ß-kazein+NH% OH IV. Indikátorreakció: D1DH a-ketoglutarát+NADPH+NH4*------------* glutamát+NADP+H20 2. Kiszerelés: 10 db 1-es jelű üveg 20 db 2-es jelű üveg 2 db 3-as jelű üveg 1 db 4-es jelű üveg 1 db 5-ös jelű üveg 1 db 6-os jelű üveg 20 x 60 meg bentonit (műanyag csövekben) 20 db műanyag keverőpálcika 3. Az üvegek tartalma: 1. puffer-szubsztrát (liofilizált) Rekonstituálás 2,2 ml deszt. vízben Koncentrációk a rekonstituált 1-es reagensben: a-ketoglutarát 13,5 mmól/l ADP 1,35 mmól/l DTT 2,84 mmól/l etilamin-HCl 78,65 mmól/l DSZ-ß-kazein 45 g/1 Hapes (pH = 7,5) 157,5 mmól/l Tárolás: 4 'C; stabil: legalább 1 évig 2. NADPH (liofilizált) 0,7155 umól mennyiségű NADPH Rekonstituálás a leírás szerint az 1-es reagenssel. Tárolás: 4 'C; stabil: 1 évig 3. trombin (liofilizált) Rekonstituálás 2,4 ml deszt. vízben Koncentráció a rekonstituált 3-as reagensben: 400 E/ml (A rekonstituált reagens többször lefagyasztható-kiolvasztható) Tárolás: +4 *C; stabil: legalább 1 évig A reakonstituált reagens tárolása: -20 *C-on 3
