202653. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai készlet és eljárás véralvadás XIII-as faktorának meghatározására
5 HU 202 653 A 6 4. G1DH (oldat) 1.3 ml; 900E/ml Tárolás: +4 *C; stabil: legalább 1 évig 5. CaCl2 (oldat) 1.3 ml; 224 mmól/1 Tárolás: +4 *C; stabil: legalább 1 évig 6. EGTA (oldat) 1.3 ml, 113 mmól/1 Tárolás: +4 *C; stabil: legalább 1 évig 4. Minta és Vakreagens összeállítása Minta reagens 1 üveg 2-es reagenshez Vakreagens 1 üveg 2-es reagenshez 1-ből 1,0 ml 1,0 ml 3-ból 200 pl 200 pl 4-ből 50 pl 50 pl 5-ből 100 pl-6-ból-100 pl A kész minta - illetve vakreagens: stabil +4 ‘C-on 6 órán át. 5. Bentonitkezelés: 1 db 60 mg bentonitot tartalmazó csőbe 1,5 ml citráttal alvadásgátló plazmát adunk. A műanyag pálcikával alaposan összekeverjük és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A 10 perc alatt kétszcr-háromszor öszszerázzuk. Centrifugáljuk. A méréshez a felülúszót használjuk. Citrátgátolt plazma készítése: 1 rész 3,3%-os trinátrium-citrátoldathoz 9 rész vért adunk és 3000 g értéken 15 percig centrifugáljuk. 6. Mérés: 0,6 ml Reagenshez 0,4 ml bentonitkezelt plazmát adunk. 37 ‘C-on 5 perc előinkubáció után 3 x 1 perc mérés (A = 340 nm-en). Minden plazmából minta- és vakreakciót is mérünk, és az FXIII aktivitást az alábbiak szerint számítjuk ki: A/perc(mmtt)- A/perc(vtk) x 403 = FXIII U/L 7. A mérés során az egyes anyagok koncentrációja: a-ketoglutarát 6 mmól/1 ADP 0,6 mmól/1 DTT 1,25 mmól/1 etilamin 35 mmól/1 DSZ-kazein 20 g/1 Hepes 70 mmól/1 NADPH 0,32 mmól/1 DLDH 20 U/ml trombin 40 U/ml * CaCl2 10 mmól/1 ** EGTA 5 mmól/1 * - bevitt CaCl2, csak a minta reagensben ** - csak a vakreagensben Jellemző paraméterek: referencia intervallum: 12,1-22,7 U/l linearitáshatár: 35 U/l reprodukálhatóság: A referencia intervallumon belül a CV 3,5%, a referencia intervallum átlagának 10%-ánál a CV 8% korreláció: A korrelációs koefficiens a monodanzilkadárverin inkorporációs módszerrel [Lorand L. et. al.: J. Clin. Invest 48,1054 (1969)]. R = 0,95 8. Reagensek összeállítása 1. reagens készítése- A oldat: 80 mg/ml-es DSZ-ß-kazeint oldunk 1 ml 157,5 mmól/1 Hepes (pH = 8,2-es) pufferben. Oldódás után (6-8 perc, kevergetés közben) a pH = 7,5-re áll be. Ha a feloldódás után a pH kisebb 7,5-nél, értékét 2 mól/1 nátrium-hidroxid adásával korrigáljuk- B oldat: A megfelelő anyagmennyiségek bemérésével elkészítünk egy 30,9 mmól/1 d-ketoglutarát, 3,09 mml/1 ADP, 6,50 mmól/1 DTT, 180,2 mmól/1 etilamin-HCl, 157,5 mmól/1 Hepes (pH = 7,5)-oldatot (A pH állításához 2 mól/1 Nátrium-hidroxidot használunk.)- 563 ml A-oldathoz 437 ml B-oldatot adunk, 2,2 mlenként kb. 1,5 cm átmérőjű kis üvegekbe mérve liofilizáljuk. (A kimért mintákat -30 *C-on fagyasztjuk, és +20 °C tálcahőmérséklet és vákuum mellett (6 órán át liofllizáljuk). 2. reagens készítésze 1,431 mmól/1 koncentrációjú NADPH-oldatot készítünk úgy, hogy a NADPH-t 20 mmól/1 nátrium-hidrogénkarbonátban oldjuk és a 0,5 ml-enként kimért anyagot az 1. reagensnél leírtak szerint liofllizáljuk. 3. reagens készítése 2,4 ml 400 E/ml-es trombin-oldatot készítünk, a trombint 10 mmól/1 Hepes (pH = 7,5) oldatban oldva és liofllizáljuk az 1. reagensnél leírtak szerint. 4. reagens készítése G1DH liofilizátumot 50%-os vizes glicerinben oldva 900 E/ml-es oldatot készítünk. 5. reagens készítése Kalcium-kloridot vízben oldva 225 mmól/l-cs oldatot készítünk. 6. reagens készítése EGTA-t vízben oldva a pH-t 2 ml/l-es nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítva 113 mmól/l-es oldatot készítünk. 9. A diagnosztikai készletben szereplő anyagok minőségi követelményei: GIDH (glutamát dehidrogenáz) specifikus aktivitás > 90 U/mg fehéijc (25 *C) ADH, LDH és MDH szennyezés <0.01 % NADPH (nikotinamid-adenin-dinukleotid foszfát, redukált) tclranátriumsó 80% ß-NADPH; <1% NADP; nátrium 11%; víz <6%; egyéb nukleotidok <2%. ADP (adenozin-5’-difoszfát) dinátrium- só 82% ADP; 9% nátrium, <6% víz, <3% AMP; <1% ATP trombin = 300 NIH E/mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
