202653. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai készlet és eljárás véralvadás XIII-as faktorának meghatározására
1 HU 202 653 A 2 A találmány tárgya diagnosztikai készlet vérplazma véralvadás Xni-as faktorának (FXIII enzim) meghatározására, az UV-kinetikus teszt reagenseinek felhasználásával. A találmány tárgya továbbá eljárás vérplazma véralvadás XIII-as faktorának meghatározására Ismert, hogy a véralvadás XIII-as faktorának (továbbiakban FXIII-nak) veleszületett vagy szerzett hiánya jól definiált, súlyos vérzési rendellenességekkel jár. A kifejezett FXIII-hiány relatíve ritka. A szerzett FXIII-szint csökkenés lényegesen gyakoribb, különösen akut leukémiákban, illetve különbőzé májbetegségekben fordul elő. Ezen túlmenően számos klinikai megfigyelés és kísérleti adat utal arra, hogy az FXIII szükséges a normál sebgyógyuláshoz és terhességhez, illetve szerepet játszik különböző patológiás állapotokban, mint például az atheroschlerosis, tumor növekedés és metastasis képződés vagy a csecsemők respiratoricus distress syndromája. Jelenleg a diagnosztikai laboratóriumokban FXIII meghatározásra csupán elvétve kerül sor, bár számos esetben indokolt lenne, egyrészt a helyes diagnózis és terápia meghatározása céljából, másrészt a patalógiás történések mélyebb részleteit feltáró klinikai kutatómunka részeként. Az, hogy az indokoltnál és szükségesnél lényegesen kevesebb számban kerül sor FXIII meghatározásra, elsősorban módszertani nehézségeknek köszönhető. Bár FXIII meghatározásra ezidáig a módszerek széles skáláját írták le, ezekre általában jellemző, hogy körülményesek, időigényesek, nem automatizálhatnak. Az úgynevezett oldékonysági tesztek különböző változatainak előnye, hogy műszerigényük nincs, viszont ezek a hosszadalmas eljárások (több óra a szükséges idő) csak kvalitatív, jobb esetben szemikvantitatív eredményt adnak. [Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 309 (1968) , Thromb. Haemorrh. 22, 575 (1969)]. Az FXIII-ellenes antitesteket használó elektroimmunodiffúziós módszerek az antigenitás tekintetében intakt fehérjék szintjét jelzik [Haematologica, 59,458 (1974), Blut, 28,81 (1974)]. Ez viszont nem feltétlenül korrelál a funkcionálisan ép, enzimatikus aktivitást mutató fehérjék mennyiségével. Ezen kívül a technika időigényes, és az antitestek relatíve drágák. Az FXIII enzimatikus aktivitás mérésére kétféle lehetőség kínálkozik. Egyrészt a transzglutamináz aktivitás meghatározása a proteinszubsztrátokba inkorporált aminok mennyiségének mérésével, másrészt az enzimhatás során felszabaduló ammónia mérése. Az amin-inkorporációs módszerek számos változatát írták le, melyekben fluoreszcens vagy izotóppal jelzett aminok inkorporációját mérik [Br. J. Haematol. 18, 399 (1970), Anal. Biochem. 50,623 (1972), Arc. Biochem. Biophys. 131, 419, (1983), J. Clin. Invest 48, 1054 (1969) ]. Bár ezek a módszerek többnyire jól reprodukálható, kvantitatív eljárások, jelentős hátrányuk, hogy idő- és munkaigényesek, valamint speciális műszert, fluorimétert vagy szcintillációs számlálót igényelnek. Az enzimhatás során keletkezett ammónia mérésén alapuló korábban leírt három módszer messze nem felel meg a rutindiagnosztikai technikák követelményeinek. Az előző eljárások hátrányait próbálta kiküszöbölni a közelmúltban leírt UV-kinetikus teszt. [Clin. Chem. 31,35 (1985)]. Ez a módszer azon alapul, hogy bentonitos kezeléssel fibrinogén-mentesített plazmában a zimogén FXIII-aktivációja Ca2+ jelenlétében trombinnal történik. Az aktív enzim (FXIIIa) etilamint köt a defoszforilált, acetilezett ß-kazeinhez (AD-ß-kazein), miközben ammónia válik szabaddá. A keletkezett ammónia mennyiségét folyamatosan lehet követni a glutamát-dehidrogenáz (G1DH) katalizált indikátorreakcióval, a NADPH-fogyását mérve 340 nm-en. Minden minta esetén vakreakciót is kell végezni, ahol a reagens trombin helyett a trombint gátló hirudint tartalmazza. A fenti módszer (a továbbiakban: az UV-kinetikus teszt) a korábbi módszerekhez képest lényeges előrelépést jelentett, de eredetileg közölt formájában nem alkalmas kereskedelmi forgalomba hozható diagnosztikai készlet ipari szintű rendszeres előállítására. Ennek fő oka a glutamin-donor-szubsztrátban, az AD-ß-kazein jellegében és eddig ismert előállítási módjában rejlik. Az aktivitásmérés kritikus pontja a megfelelő glutaminszubsztrát megválasztása. Az FXIIIa katalizált reakcióban csak néhány fehérje, illetve ezek fragmentumai bizonyultak megfelelő amin-akceptoroknak. A természetes szubsztrát-fibrinen kívül általában kazeineket és kazein-származékokat használnak. A jól definiált ß-kazein alkalmazása - amely kiváló szubsztrátja az enzimnek - mindenképpen előnyösebb a különböző kazeinelegyek használatánál. A defoszforilálás a fotometriás módszerrel interferáló, turbiditást okozó kalcium-kazeinát képződését akadályozza meg. A lizin oldalláncok blokkolása a kazein-kazein keresztkötésekből adódó turbiditásnövekedést védi ki. A Clinical Chemistry-ben leírt módszerben a ß-kazein előállítása ioncserélő kromatográfiával, a lizinoldalláncok blokkolása pedig acetilálással történik. Ioncserélő kromatográfiával azonban a ß-kazein előállítása nehézkes, időigényes és ebből fakadóan igen költséges. A lizinoldalláncok acetilálásával előállított AD-ß-kazein pedig a megfelelő koncentrációban nehezen oldható és a preparátumok egy része Ca2+ hozzáadására - a kimerítő defoszforilálás ellenére is - a megengedettet meghaladó, időben fokozódó turbiditásnövekedést mutat. A leírt eljárással kapott AD-ßkazein változó minőségű, mely csak esetenként felel meg az FXIII aktivitásmérés követelményeinek. További probléma, hogy a vakreakcióban használt alvadásgáüó, a hirudin rendkívül drága, ill. csak piócákból és ezekből is csak nehezen és költségesen állítható elő. Jelen találmány célja tehát olyan diagnosztikai készlet, ill. reagens-csoport kidolgozása, melynek használatával a fenti nehézségek kiküszöbölhetők. Kísérleteink során azt találtuk, hogy az FXIIIa glutaminszubsztrátjaként olyan ß-kazein-származékot kell választani, mely kedvezőbb oldékonyságot mutat. Meglepő módon a számtalan ß-kazein származék közül a defoszforilältszukcinil-ß-kazein (a továbbiakban: DSZ-ß-kazein) kiugróan kedvezőnek mutatkozott, míg vakreagensként az etilénglikol-bisz-$-aminoetil-éter)-N,N,N’,N’-tetraecetsavat, a továbbiakban EGTA-t, találtuk nagyságrendileg jobb hatásúnak. A találmány továbbá azon a felismerésen alapul, hogy lehet olyan reakciókörülményeket beállítani, melynek során a ß-kazein - még kazein-elegyben is - teljes mértékben defoszforilálható. Ezen túlmenően sikerüli meghatároznunk a legkedvezőbb Ca2t-koncentrációt, inkubálási időt, hőmérsékletet, amellyel igen magas tisztaságú DSZ-ß-kazein állítható elő. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
