202596. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-aciloxi-biciklo [3.3.0] oktán-7-on-2-karbonsav-észterek recemát-hasítására sztereospecifikus enzimes vagy mikrobiológiai acilát-hidrolízissel
13 HU 202 596 B 14 ban, és 750 mg „Sclerotinia” lipáz (Nagasa cég) 100 mg 7 pH-jú 0,1 mólos foszfálpufferral készített oldatával elegyítjük. Rázógépen 28 ’C-on végzett 30 órás rázás után az oldat pH-ját 0,1 n nátrium-hidroxid oldattal 9,0-ra állítjuk, majd metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, és az extraktumot vákuumban szárazra pároljuk. így 105 mg (+)-3a-hidroxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-metil-6sztert kapunk, amelynek fajlagos forgatási értéke: [a] n = = +24,0* (c = 1,08; kloroform). 17. példa 300 mg (±)-3a-acetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktán-2p-karbonsav-etil-észtert (10 képlet) oldunk 9 ml etanolban, és 750 mg sertéspankreászból származó lipáz (Chemical Dinamics Corporation cég) 100 mg 7 pH-jú foszfátpufferral készült oldatával elegyítjük. Az oldatot körkörös rázógépen rázatjuk 28 ’C-on, közben a reakció lefutását folyamatosan kivett minták analízisével követjük. 1 óra reakcióidő után a beadagolt szubsztrát 50%-a átalakul. Az elegyet 3-szor extraháljuk metil-izobutil-ketonnal, az extraktumokat egyesítjük, vákuumban szárazra bepároljuk, és az elreagálatlan észter-acilát elválasztása céljából szilikagéllel töltött oszlopon diklór-metán diklór-metán/10% aceton gradienssel kromatografáljuk. Ily módon 100 mg (+)-3a-hidroxi-7,7-(2^-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo-[3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-etil-észtert kapunk, amelynek fajlagos forgatása: [a] g* = +23,8’ (c = = 1,215; kloroform). 18. példa A 17. példában leírt körülmények között 300 mg (±)-3a-acetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktiin-2ß-karbonsav-etil-esztert (10 képlet) lóra hosszat reagáltatunkl, 5 ml (1:40hígítású) sertésmáj-észteráz (Boehringer Mannheim cég) 100 ml 7 pH-jú foszfátpufferral készített oldatával. Metil-izobutil-ketonnal végzett extrakció és szilikagéllel töltött oszlopon történő kromatografálás után 118 mg (+)-3<x-hidroxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo-[3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-etil-6sztert kapunk, amelynek fajlagos forgatása: [a] g> = +24,3’ (g = 1,075; kloroform). 19. példa A17. példában leírt körülmények között 300 mg (±)-3aacetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-benzil-6sztert (11 képlet) 1 óra hosszat reagáltatunk 750 mg Alcaligenes eredetű lipáz-PL (Meito Sangyo cég) 100 ml 7 pH-jú foszfátpufferral készített oldatával. Utána az elegyet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az extraktumot szárazra bepároljuk, és a maradékot szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Ilyképpen 105 mg (+)-3<x-hidroxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo-[3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-benzil-6sztert kapunk, amelynek fajlagos forgatása: [a] g* = +23,9' (c = 1,045; kloroform). 20. példa A 17. példában leírt körülmények között 300 mg (±)-3a-acetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo[3.3.0] oktan-2ß-karbonsav-benzil-6sztert (11 képlet) 3 óra hosszat reagáltatunk 750 mg Candida cyclindracea-ból származó lipáz My (Meito Sangyo cég) 100 ml 7 pH-jú foszfátpufferral készített oldatával. Utána az elegyet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az extraktumot szárazra bepároljuk, és a maradékot szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. így 115 mg (+)-3a-hidroxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo-[3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-benzil-észtert kapunk, amelynek fajlagos forgatása: [a] g* = +24,5’ (c = = 1,145; kloroform). 21. példa A 8. példában leírt körülmények között az Alcaligenes paradoxus (ATCC 17713) törzs tenyészetével reagáltatunk 6 g (±)-3a-acetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-metil-észtert (1 képlet). A szubsztrát hozzáadása után 4 órával a beadagolt racemát 50%-a átalakul. Az elegyet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, és az extraktumot vákuumban szárazra bepároljuk. A kapott maradékot a nem természetes konfigurációjú elhidrolizált enentiomer elválasztása céljából szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Ekkor 1. frakcióként az abszolút konfigurációban aPGI2 természetes prosztaciklinének megfelelő (+)-II általános képlettel ábrázolható elhidrolizálatlanul maradt enantiomer jelenik meg. A frakció szárazra párlásával 2,4 g (+)-3a-acetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo [3.3.0] okt0n-2ß-karbonsav-metil-észtert kapunk nem kristályosodó olajként, amelynek fajlagos forgatása: [a] g* = +2,2* (c = 1,11; kloroform). 22. példa Sertéspankreászból (gyártó a Chemical Dynamics Corporation) származó lipáz immobilizálása Eupergit C-n (gyártó a Röhm Pharma NSZK). 1 g sertéspankreászból származó lipázt szuszpendálunk 40 ml 1M foszfátpufferben (pH = 7,5) és hozzáadjuk 10 g Eupergit C-hez. Jól összekeverjük és 3 napig szobahőfokon inkubáljuk. Ezután az immobilizátumot leszivatjuk, kétszer 200 ml 0,1 M foszfátpufferrel mossuk és 0,1 M foszfátpufferben 4 ‘C-on tároljuk. Enzimes reakció: 21 Erlenmeyer-lombikban 20 g Eupergit C-lipáz immobilizátumot szuszpendálunk 1 liter 7-es pH-jú foszfátpufferben. Ezután hozzáadjuk a szubsztrátumot 500 mg (±)-3-acetoxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo[3.3.0] oktän-2ß-karbonsav-metil0szter (1 képlet) 25 ml etanollal készített oldata alakjában és 16 órát rázzuk 30 *C-on rázógépen. Ezután az immobilizált enzimet G2-jelű zsugorított üvegszűrőn leszivatjuk és kevés foszfátpufferrel mossuk. A szűrletet kétszer 500 ml metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az egyesített extraktumokat nátrium-szulfát fölött szárítjuk és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot Kieselgel oszlopon kromatografáljuk (gradiens: 1,8 1 metilén-klorid -1,81 metilén-klorid/5% aceton). Az első frakció tartalmazza az át nem alakult acetoxi-biciklooktán-metilésztert, a 2. frakcióban 320mg (+)-3a-hidroxi-7,7-(2,2-dimetil-trimetiléndioxi)-cisz-biciklo-[3.3.0] okt0n-2ß-karbonsav-metil0sztert kapunk, amelynek olvadáspontja 62-63 ‘C. Forgatóképesség: [a] g> = +25,5’ (c = 1,001; kloroform). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
