202591. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BU-3420T antibiotikum, valamint ilyen antibiotikumot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
13 HU 202 591 B 14 A fenti adatok alapján a BU-3420T PD50 értéke intramuszkuláris adagolás után 0,13 mg/kg. A BU-3420T daganatgáüó hatása A BU-3420T antibiotikum in vitro mutatott citoxicitását több rágcsálótumoron és humán daganatsejttörzsön vizsgáltuk; in vivo daganatos egereken vizsgáltuk a daganatgáüó hatást Összehasonlító vegyiiletként mind az in vitro, mind az in vivo kísérletekben mitomicin C-t alkalmaztunk. B16-F10 (rágcsáló melanoma), P388 (rágcsáló leukémia), P388/VCR (vinkrisztinnel szemben rezisztens P388) és Moser (emberi vastagbélvégbél-karcinóma) sejteket dúsított Eagle-féle minimál táptalajon, amelyet 10% borjúmagzatszérummal és 60 pg/ml kanamicinnel egészítettünk ki, a logaritmikus fázisig tenyésztettünk; a HCT-116 (emberi végbélkarcinóma) sejteket 10% borjúmagzatszérummal, 100 pg/ml penicillinnel és 100 pg/ml streptomicinnel kiegészített Maccoy-féle 5 A közegben tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, és 96- vagy 24-üreges szövetkultúra-lemezre oltottuk 1,5 x 105,1,2 x 10*, 2,5 x 105 és 3 x 105 sejt/ml koncentrációban. A vizsgálandó hatóanyagokat a lemez üregeiben előzőleg helyeztük el. Ezután 37 ’C hőmérsékleten 72 órán át 95% levegőt és 5% széndioxidot tartalmazó, nedvesített atmoszférában inkubáltunk. A B16-F10, Moser és HCT-116 ellen mutatott citotoxikús hatást az élő sejteknek 0,006%-os neutrálvörös-oldattal történt megfestése után 540 nm hullámhosszon kolorimetriásan határoztuk meg. A p388 és P388/VCR sejtek ellen kifejtett citotoxikus hatást az élő sejtek számlálásával határoztuk meg. Eredményeinket a 8. táblázatban összegeztük. A BU-3420T mind a rágcsáló-tumor ellen, mind az emberi daganattörzs ellen jelentős citotoxikus hatást fejtett ki. Jóllehet az emberi daganatsejtek, a Moser és HCT-116 sejtek valamivel rezisztensebbnek adódtak a mitomicin C-vel szemben, mint a rágcsáló daganatsejtek (B16-F10), viszont 6-12-szer érzékenyebbeknek bizonyultak a BU-3420T hatásával szemben. A BU-3420T a vinkrisztinnel szemben érzékeny és ellenálló P388 sejtekkel szemben azonos citotoxikus hatást mutatott Meghatároztuk a BU-3420T gátló hatását makromolekulák (DNS, RNS és fehérje) szintézisére in vitro kísérletben. Tenyésztett L1210 sejteket (5 x 103 sejt/ml) BU-3420T-vel 37 *C-on 15 percig előinkubáltunk. A tenyésztőelegyhez izotóposán jelzett prekurzort - 3H-timidint, 14C-uridint, vagy 3H-leucint - adtunk, és az inkubálást 60 percig folytattuk. Ezután mosást végeztünk hűtött 5%-os diklór-ecetsavval, majd a tumorsejtek savban oldhatatlan frakciójának radioaktivitását folyadékszcintillációs számlálóban határoztuk meg. Amint a 9. táblázatból látható, a BU-3420T a DNS-szintézist körülbelül 500-szor, illetve 100-szor erősebben gátolta, mint az RNS-, illetve fehérjeszintézist. A BU-3420T antibiotikum daganatgátló hatását in vivo daganatos CDF, egereken állapítottuk meg. Nőstény CDF! egereket 0,5 ml 10%-os B16 melanóma-sejtpéppel intraperitoncálisan oltottunk. A vizsgálandó vegyületeket intraperitoneálisan adagoltuk az egereknek az alábbi kezelési rend szerint: az 1., 2. és 3. napon naponta egyszer (QD x 3); az 1., 5. és 9. napon naponta egyszer (Q4D x 3); és az 1-9. napon naponta egyszer (QD x 9). Amint a 10. táblázatból látható, a BU-3420T antibiotikum határozottan kedvezően hatott a P388 daganatsejtek gátlására széles dózishatárok között, bár T/C értéke alacsony szinten maradt, a maximális T/C érték 135%-nak adódott. A hatóanyag legalább 10-szer hatásosabb a mitomicin C-nél a minimális hatásos dózis alapján. A B16 daganatsejtek esetében a BU-3420T vegyület megközelítőleg azonos eredményeket adott a P388 sejtekkel szemben elért eredményekkel (11. táblázat). 8. táblázat In vitro citotoxicitás rágcsáló és emberi daganatsejtekkel szemben ICíoOig/ml) Vegyület B16-F10 P388 P388/ /VCR Moser HCT-116 BU-3420T 0,0052 0,0004 0,0004 0,00085 0,00042 MitomicinC 0,5 ND* ND* 1,2 0,8 *ND = nem vizsgáltuk 9. táblázat A makromolekula-szintézis gátlása L1210 leukémiasejtekben ________ICsOÍgg/ml) Vegyület DNS RNS Fehérje BU-3420T 0,018 9,2 1,5 Mitomicin C 1,7 >100 >100 10. táblázat A P388 leukémiasejtekre kifejtett daganatgáüó hatás intraperitoneális adagolás után (i.p.) Vegyület Dózis*1 MST*2 (mg/kg/nap) (nap) T/C (%) Testtömegváltozás a 4. napon (g) BU-3420T 1,0 13,5 135'3-0,5 0,5 13,0 130'3 0,0 0,25 13,5 135*3 +0,8 0,13 13,0 130*3 +0,8 0,063 13,0 130*3 +0,3 0,031 13,0 130*3 +1,0 Mitomicin C 3,0 20,0 200'3-1,0 1,0 13,5 135*3 +0,5 0,3 14,0 140*3 +1,0 0,1 11,5 115 +1,8 Vivőanyag-10,0-+2,4 *‘ QD x 3 i.p. *2 áüagos túlélési idő *3 szignifikáns daganatgátló hatás (T/C >125%). 11. táblázat A B16 melanómasejtekre kifejtett daganatgáüó hatás ______________________(i-P-)_____________________ Vegyület Dózis 1 MST 2 T/C Testtömeg (mg/kg/nap) (nap) (%) változás a 5. napon _______________________________________(g) BU-3420T 1,0 21,5 159*3 -0,5 0,5 18,5 137*3 -0,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
