202589. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D,C-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav immobilizált sejtekkel történő szétválasztására
1 HU 202 589 B 2 A találmány tárgya javított eljárás D,L-2-amino4-metil-foszfino-vajsav immobilizált sejtekkel történő szétválasztására. Az L-2-amino-4-metil-foszfino-vajsav (az alábbiakban: L-foszfinotricin vagy L-PTC), valamint szerves vagy szervetlen bázisokkal és savakkal képzett sói a kémiailag könnyen hozzáférhető racemátok igazi hatóanyagai (2 939 269 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat). A 27 17 440 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat alapján az L-PTC kiemelkedő és széles hatáskörű herbicid tulajdonságú számos egyszikű és kétszikű, nyári és évelő gyomnövényekkel szemben. Mivel az L-PTC és ennek felsorolt származékai a raccmátokkal összevetve kétszer olyan erős hatásúak, ezért kívánatos volt olyan eljárást kidolgozni, amellyel az L-PTC egyszerű módon nagy mennyiségben előállítható. Az L-PTC L-PTC-alanil-alanin savas hidrolízise (73-85538 számú japán közrebocsátási irat) vagy enzimes lebontása (74-31890 számú japán közrebocsátási irat) útján állítható elő; az L-PTC-alanil-alanin az irodalomból ismert, mikrobiológiai úton nyert antibiotikum. A 29 39 269. számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratban ismertetett eljárás szerint N-acil-L-PTC (különösen N-acctil-L-PTC) a Pseudomonas, Streptomyccs vagy Aspergillus nemzetségbe tartozó, különleges módon tenyésztett törzsekből származó, egész sejtek vagy sejtkivonat alakjában alkalmazott mikróbiális acilázzal gyorsabban bontható, mint a megfelelő D-származék. A feldolgozás után nyert PTC-nck csak egy maximális fajlagos forgatási értéke van: f a ] d =23’ (c= 1, In Hcl), ami 75%-os optikai tisztaságnak felel meg. A 30 48 612 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásból ismert, hogy a racém foszfinotricin N-aracctil-származékait a pcnicillin-G-aciláz, különösen az E. coli ATCC 11105-ből származó enzim nagyobb kitermeléssel hasítja, mind szabad, mind immobilizált formában. Meglepő módon azt találtuk, hogy immobilizált E. coli sejtekkel az eljárás lényegesen javítható, mert hosszabb az immobilizált sejtekből álló biokatalizátor élettartama és kisebb az aktivitás-veszteség. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás DJL-2- -amino-4-metil-foszfmo-vajsav szétválasztására. Az eljárásra jellemző, hogy az említett vegyülel (I) képlctű fcnacetilszármazékát vizes vagy vizes-szerves közegben kitozánon vagy kitozánban immobilizált E. coli ATCC 11105 sejtekkel 20-45 °C-on, 3 és 9 közötti pH-érték mellett inkubáljuk. Az alábbiakban a találmányt részletesebben ismertetjük. Az E. coli ATCC 11105 sejteket szokásosan alkalmazott, szakember által ismeri tápközegben tenyésztjük, majd a tápközegből kiszűrjük és ismert módon, előnyösen a 2 835 875,3 005 632 vagy 3 003 633 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás szerint kitozánon immobilizáljuk. A szubsztrátumot keverék (batch) eljárásban vagy folyamatos oszlopon végzett eljárásban inkubálhatjuk az immobilizált sejtekkel. Gazdaságosabb a folyamatos eljárás. Előnyösen úgy járunk el, hogy a szubsztrátum oldatát folyamatosan, az N-fenacetil-L-foszfinotricin teljes dczacetilczésésig áramoltatjuk az álló fázisként immobilizált E. colit tartalmazó oszlopon keresztül. A vizes szubsztrátoldatot a racém foszfinotricin-származékot 0,1-30 t%, előnyösen 7-15 t% koncentrációban tartalmazza. A reakcióhőmérséklet 20-45 °C, előnyösen 30-40 °C. A sejtek kielégítő reakcióképességét érjük el, ha 3-9 pH-n, előnyösen 6-8,5 pH-n dolgozunk. Ha a vizes reakcióoldathoz szerves oldószert, így például ecetsav-butilésztert, terc-bulil-mctil-étert vagy mctil-izobulil-ketont adunk a telített oldat keletkezésére szükséges mennyiségben, illetve ha az immobilizált sejteket időnként ilyen oldószerrel mossuk, az immobilizált sejtekből álló biokatalizátor élettartama nő. A reakció lefolyását és végét polarimetriás módszerekkel vagy a keletkezett szabad aminosavak ninhidrincs reakciója, majd fotometriás mérése útján ismert módon végzett mennyiségi meghatározásával követhetjük nyomon. Előnyösen azonban nagynyomású folyadék kromatográfiás módszerrel határozzuk meg felszabadult fenilecetsav mennyiségét. A nagy kitermeléssel előállított L-PTC fajlagos forgatása [ aj d = + 38,5 (c = 1,1 n HC1), amely 90%-os optikai tisztaságnak felel meg. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a biológiai raccmát szétválasztásának gazdaságosságát a találmány szerinti eljárással, E. coli ATCC 11105 sejtek alkalmazásával jelentősen fokozhatjuk, annak ellenére, hogy a reakcióban fcnil-ecetsav szabadul fel, ugyanis jelentősen kisebb az aktivitás-veszteség és az immobilizált pcnicillin-acilázzal összehasonlítva jelentősen hoszszabb a biokatalizátor élettartama. A találmány szerinti megoldást a következő kiviteli példákkal szemléltetjük. Az L-foszfinotricin elkülönítése a 3 048 612 sz. NSZK-beli közrebocsátási iratban rögzítettek szerint történik. Kiviteli példák Penicillin-G-acilázt a 27 32 301 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat 1. vagy 2. példája szerint (1. sz. biokatalizátor) vagy a 33 44 912 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat 7. példája szerint (2. sz. biokatalizátor) rögzítünk. E. coli ATCC 11105 sejteket a 30 05 632 sz. német szövetségi köztársaságbcli közrebocsátási irat 1. példája szerint immobilizálunk (3. sz. biokatalizátor). Az 1. és 2. biokatalizátor aktivitása mintegy 170 egység/g (nedves) hordozó x perc, míg a 3. biokatalizátor aktivitása 25 egység/ml hordozó x perc; az aktivitást penicillin-G-káliumsó 1 t%-os vizes oldatának 37 °C-on történő hidrolízisével szemben határoztuk meg. 1. példa 10 t%-os fenacetil-foszfinotricin-dinátrium-oldatot 7,7 pH mellett 35 °C-ra melegítünk, majd 20 ml/óránál nagyobb áramlási sebességgel az oldatot 10 g 1. vagy 2. biokatalizátort tartalmazó üvegoszlopon keresztül szivattyúzzuk. A pH-értéket 0,1 n nátrium-hidroxid-oldattal vagy 0,1 n ammóniaoldattal 7,7-re állítjuk. A szubsztrátoldatot és a termékáramot 35 ml/óra térfogatsebcsséggcl a kívánt átalakítástól függően cirkuláltatjuk vagy elvezetjük. A biokatalizátor aktivitását penicillin-G-káliumsó 1 t%-os vizes oldatának 37 ‘C-on történő hidrolízisével 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
