202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
17 HU 202 587 B 18 A kapott 950 bázispárból álló fragmens BamHI és Sáli kohézív végeket hordoz, a fragmenst ismert módon tisztítjuk, 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz puffcrban oldjuk, a pufferhoz előzőleg 0,2 (lg klónozó vektor dezoxi-ribonukleinsavat (lásd előbb) és 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet adunk. 16 órán át 4 'C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsawal E. coli K12 HB 101 sejteket transzformálunk. Az ampicillinre rezisztens transzformánsokból plazmidot izolálunk, és a Sall-BamHI fragmens jelenlétének vizsgálatára ismert módon analizáljuk. Az előállítandó 5,2 kb nagyságú fragmenst pKEN021 jellel jelöljük (3. ábra: 106). 10 pg pKEN021 plazmidot 37 ’C hőmérsékleten 200 pl alábbi összetételű Xbal-BamHI pufferban emésztünk: 150 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 6 mmól/1 ß-meikapto-etanol. Az emésztést 10 egység BamHI enzimmel végezzük 1 órán át. Ezután 10 egység Xbal enzimmel folytatjuk az emésztést 37 °C hőmérsékleten. A kapott Xbal-Bam- HI emésztett dezoxi-ribonukleinsavat 2,5 egység alkalikus foszfatázzal kezeljük 1,5 órán át 65 °C hőmérsékleten, majd fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapva összegyűjtjük, és további felhasználáshoz 50 pl TEN-pufferban oldjuk (3. ábra: 107). B) A pNM575 plazmid előállítása A humán növekedési hormon génjének kódoló szekvencia részét tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav fragmens forrásaként a ptrpED50chGH800 plazmidot használjuk [4. ábra: 108; Martial és munkatársai, Science, 205, 602-607 (1979)]. Ezt a fragmenst szintetikusan is előállíthatjuk [Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978), lásd előbb], vagy ismert módon izolálhatjuk [Goodman és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 75-90 (81979)]. Ebben az esetben humán növekedési hormont meghatározó hírvivő ribonukleinsavat izolálunk (mRNS) humán agyalapi mirigyből. A humán növekedési hormon génjének egy részét hordozó ptrpED50chGH800 plazmid egyetlen Smal restrikciós helyet tartalmaz a gén transzlációs terminációs kodonjától jobbra 6 bázispárral. Ezt a helyet BamHI helyre változtatjuk az alábbiak szerint eljárva: 6 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 6 egység Smal enzimmel emésztünk 200 pl alábbi összetételű Smal restrikciós pufferban: 15 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, 6 mmól/1 magnézium-diklorid, 15 mmól/1 kálium-klorid és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. 1,5 órán át 37 'C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Miután az emésztés teljes, fenol és kloroform elegyével extrahálunk, a dezoxi-ribonukleinsavat pedig etanolos kicsapással elkülönítjük. A csapadékot 24 pl TEN elegyben oldjuk. 40 pmól foszforilezett BamHI adapter fragmenst (Collaborative REsearch) adunk 0,5 pg (0,2 pmól végekre számítva) fenti módon emésztett plazmidhoz 16 pl, 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmazó ligáz pufferban. 2 órán át 22 *C hőmérsékleten, 16 órán át 4 °C hőmérsékleten, végül 10 percen át 65 *C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. BamHI restrikciós enzimmel ismert módon kohéziv végeket állítunk elő. Az enzim hasítja a linker szekvenciát és a klónozott humán növekedési hormon cDNS szekvencia kezdeténél lévő BamHI helyet így BamHI végekkel rendelkező, 691 bázispárból álló fragmenshez jutunk, ezt 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen ismert módon szeparáljuk és elkülönítjük. Az elkülönített dezoxi-ribonukleinsav fragmenst Egáljuk 0,2 pg BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett és alkalikus foszfatázzal kezelt pBR322 dezoxi-ribonukleinsavval (4. ábra: 102), a ligálást 20 pl, előzőekben megadott összetételű 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmazó pufferban végezzük. 16 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd ezután Wensink és munkatársai [Cell., 3,315-325 (1974)] szerint eljárva E. coli JA221 (NRRL B-15014) sejteket transzformálunk. A transzformánsokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, és a bennük lévő plazmidot ismert módon izoláljuk, ezután pedig restrikciós enzimes és gél-elektroforetikus analízissel azonosítjuk. Az előállított pNM575 jelű plazmid (4. ábra: 109) körülbelül 700 bázispárból álló BamHI fragmenst tartalmaz. Ezt ismert módon sokszorosítjuk további felhasználásra. C) A pNM702 plazmid előállítása Az érett humán növekedési hormon dezoxi-ribonukleinsav szekvenciájában egy FnuDII hely található, ez az első nukleotidtól 47 bázispámyi távolságban helyezkedik el. 25 pg pNM575 dezoxi-ribonukleinsavat 25 egység BamHI enzimmel emésztünk 250 pl BamHI pufferban 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. A BamHI kohéziv végekkel rendelkező, 691 bázispárból álló fragmenst 6% poliakril-amidot tartalmazó gélről izoláljuk és tisztítjuk ismert módon. A fragmens tisztítása után a termék 1/3-át (8 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavval, ekvivalens) 2,5 egység FnuDII enzimmel emésztjük, 100 pl alábbi összetételű FnuDII pufferban: 6 mmól/1 nátrium-klorid, 6 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, 6 mmól/1 magnézium-diklorid, és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. Az emésztést 37 °C hőmérsékleten végezzük 1,5 órán át. Az 538 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve ismert módon izoláljuk. A fragmens tartalmazza az utolsó, 175 aminosavat meghatározó kódoló szekvenciát, és ezután pedig egy transzlációs stop jelet. A foszfo-triészter módszert használva kétszálú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst (5. ábra: 110) szintetizálunk az lpp promoter kapcsolásához a humán növekedési hormont leíró kódoló régióval. A kétszálú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst (5. ábra: 110) az alábbi szekvenciájúnak találtuk: Xbal 5 ’-CTAG AGGGTATTAATAATGTTCCC ATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAA-3 >----------TCCC ATAATTATTAC AAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTTCC ATTCCCTT ATCCAGGCTTTTTG AC AACGCT - ATGCTCCG-3’ FnuDII GGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGC-GATACGAGGC-5’. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
