202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
19 HU 202 587 B 20 A fragmenst az ismert foszfo-triészter módszert használva állítjuk elő, a fragmenst a következő szegmensekből állítjuk össze: 1. CTAGAGGGTAT 2. TAATAATGTTCC 3. CATTGGATGAT 4. GATGATAAGTTCC 5. CAACCATTCCC 6. TTATCCAGGC 7. TTTTTGACAACG 8. CTATGCTCCG 9. C ATT ATT AATACCCT 10. ATGGGAA 11. CTTATCATCATCCA 12. GGTTGGGAA 13. GG ATAAGGG AAT 14. GTCAAAAAGCCT 15. CGGAGCATAGCGTT. A fentiek szerint előállított szegmenseket T4 ligázzal katalizált reakció segítségével egyenként kapcsoljuk egymáshoz, az alábbiak szerint eljárva: a) az 5’-nem foszforilezett 1. szegmenst 5’-foszforilezett 9. szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett szegmenshez, amikor megkapjuk az 1 duplexet [Brown és munkatársai, 68, 109-151, Methods in Enzymology (1797)]. A duplexet preparatív gél-elektroforézissel izoláljuk 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen. b) Az 5’-foszforilezett 3 szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 4 szegmenshez T4 ligáz segítségével 5’-foszforilezett 11 szegmens jelenlétében, amikor megkapjuk a 2 duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk. c) Az 5’-foszforilezett 5 szegmenst 5’-foszforilezett 12 és 13 szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 6 szegmenshez, amikor megkapjuk a 3 dezoxi-ribonukleinsav duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. d) Az 5’-foszforilezett 7 szegmenst 5’-foszforilezett 14 és 5’-nem foszforilezett 15 szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 8 szegmenshez, amikor megkapjuk a 4 dezoxi-ribonukleinsav duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. e) A 2, 3 és 4 dezoxi-ribonukleinsav duplexeket T4 ligáz enzimmel összekapcsoljuk, és a kapott 5 dezoxi-ribonukleinsav duplexet 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. f) Az 5’-foszforilezett 10 szegmenst és az 5 dezoxiribonukleinsav duplexet T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 1 dezoxi-ribonukleinsav duplexhez. A kapón dezoxi-ribonukleinsav duplexet (5. ábra: 110) 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav duplexet ezután T4 polinukleotid-kináz enzimmel enzimatikusan foszforilezzük és a foszforilezést (gamma-P32) ATP jelenlétében végezzük. A pNM702 expressziós plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pKEN021 plazmid (5. ábra: 107) Xbal-BamHI fragmensét (0,1 pmól; 0,4 (tg) enzimatikusan kapcsoljuk 0,05 pmól szintetikus dezoxi-ribonukleinsav fragmenshez (5. ábra: 110) és 0,3 pmól (0,08 (tg) 538 bázispárból álló fragmensünkhöz (5. ábra: 109) 24 pl reakcióelegyben, 1,5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében. 16 órán át 4 *C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd az előzőekben megadottak szerint E. coli JA221 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat 100 (tg/ml ampicillint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, majd az adott expressziós plazmid forrásaként tenyésztjük. A humán növekedési hormon kifejeződését ismert radioimmun-méréssel határozzuk meg [Twomey és munkatársai, Clin. Chem., 20,389-391 (1974)]. A mérések szerint egy sejtben legalább 2 millió molekula szintetizálódik. D) A pNM789plazmid előállítása Kiindulási anyagként a pNM702 plazmidot használjuk (6. ábra: 111); ez a humán növekedési hormon expressziós plazmidja. Az előállított plazmid az alábbi aminosav szekvenciát fejezi ki: Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-bGH. A szarvasmarha növekedési hormon egy részét meghatározó kódoló szekvenciát hordozó két dezoxi-ribonuklcinsav fragmenst a pBR348 plazmidból (6. ábra: 112), [Miller és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255,7521- 7524 (1980)] izoláljuk. A plazmid a pBR322 plazmid PstI restrikciós helyére klónozva tartalmaz egy 831 bázispárból álló, szarvasmarha növekedési hormont meghatározó szekvenciát A Miller és munkatársai (1980) által megadod eljáráson kívül a szarvasmarha növekedési hormont leíró szekvenciát előállíthatjuk szintetikusan [Itakura és munkatársai, 1977, vagy Crea és munkatársai, 1978], vagy előállítható ismert módon Goodman és munkatársai (1979) a szarvasmarha agyalapi mirigyéből izolált hírvivő ribonukleinsavból kiindulva. A humán és a szarvasmarha növekedési hormont meghatározó kódoló szekvencia igen hasonló, és több homológiát mutat A szarvasmarha növekedési hormont kifejező plazmid előállításakor különösen előnyösen használható a PvuII restrikciós enzimmel kapott fragmens elegy. A keletkező fragmensek 497 bázispár nagyságúak humán növekedési hormon és 494 bázispár hosszúak a szarvasmarha növekedési hormon esetén, a megfelelő restrikciós helyek hasonló leolvasási fázisban vannak mindkét szekvencia esetén. 10 (tg pNM702 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat (6. ábra: 111) egy egység PvuII restrikciós enzimmel részlegesen emésztünk 200 (ti alábbi összetételű PvuII restrikciós pufféiban: 60 mmól/1 nátrium-klorid, 6 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, 6 mmól/1 magnézium-diklorid, és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. A reakciót 37 *C hőmérsékleten végezzük 10 percen át. A reakció leállítására 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet majd a dezoxi-ribonukleinsavat alkalikus foszfatázzal kezeljük és a fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el. A 497 bázispárból álló PvuII fragmensnek megfelelő lineáris dezoxi-ribonukleinsavat (6. ábra: 113) ismert módon izoláljuk, tisztítjuk és használjuk fel a köztes plazmid (6. ábra: 114) előállítására. A lineáris fragmens valamivel gyorsabban mozdul el a gélen, mint az egyetlen helyen hasított plazmid. A pBR348 plazmid 494 bázispáiból álló PvuII frag-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
