202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
11 HU 202 587 B 12 arch, 9,133 (1981)], annak érdekében, hogy elkerüljük komplementer bázisok keletkezését a hírvivő ribonukleinsavban. Az ilyen komplementer bárzisok között létrejövő hidrogénhíd-kötések miatt hurok konfigurációk jönnek létre, és az átfedések csökkentik a transzláció hatékonyságát Az első cisztront létrehozó nukleotid tripletek előnyösen létrehozzák a transzkripció során a riboszóma kötőhelyet, mégpedig megfelelően elhelyezve az 5’-vég felé a második transzlációs start kodonhoz képest. Ezt elérhetjük úgy, hogy olyan nukleotid tripleteket választunk ki, amelyek legalább két kodont reprezentálnak, amelyek nemcsak aminosavakat határoznak meg, hanem együtt létrehozzák a kívánt riboszóma kötőhelyet is. A témában jártas szakember érti, hogy a fentiekben ismertetett összes módosítás és variáció könnyen szintetizálható az előzőekben megadott szintetikus módszereket használva. így a találmány szerinti eljárás nemcsak a példaként említett dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákra és plazmidokra vonatkozik. A találmány tárgya továbbá új eljárás funkcionális polipeptidek előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy 1. egy kompetens sejtet szelektálható és autonóm replikálódó olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav kifejeződő vektorral transzformálunk, amely áll: a) egy pepiidet vagy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciával leolvasási fázisban levő transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciából, ahol a pepiidet vagy polipeptidet kódoló szekvencia a peptid vagy polipeptid karboxil-terminális végét leíró nukleotid triplet közvetlen szomszédságában és attól a 3’-vég felé egy transzlációs stop jelet tartalmaz, b) a fenti stop szignál közvetlen szomszédságában és attól 3’-irányban elhelyezkedő transzlációs start jelből, amely a funkcionális polipeptidet leíró nukleotid-szekvenciával leolvasási fázisban van, és amely funkcionális polipeptidet meghatározó szekvencia egy transzlációs stop jelet tartalmaz a funkcionális polipeptid karboxil-terminális végét meghatározó nukleotid triplet közvetlen szomszédságában és attól 3’-irányban, és 2. a transzformált sejtet a gén kifejeződésére alkalmas körülmények között tenyésztjük. • A fenti módszer megoldja azt a problémát, amikor gyenge vagy egyáltalán nem következik be a génkifejeződés, olyan esetekben, amikor a húvivő ribonukleinsav instabil, nem megfelelő konfigurációjú, vagy nem rendelkezik a riboszómákhoz való hatékony kötődéshez szükséges megfelelő szekvenciával. A találmány szerinti eljárással megoldódik ez a probléma oly módon, hogy két cisztronból álló egyetlen hírvivő ribonukleinsav transzkriptum keletkezik A vektor első peptidjét vagy polipeptidjét meghatározó szekvencia transzkripciót követően tartalmazza az első cisztron üzenetét, ez megszünteti a hurkok képződését a hírvivő ribonukleinsav másodlagos szerkezetében. Ezek az előnytelen konfigurációk, amelyek valószínűleg gátolják a megfelelő kötődést a riboszómához és így a transzlációt és kifejeződést, nem jönnek létre, mert olyan nukleotidokat választunk ki, amelyek transzkripciókor nem generálnak komplementer bázisokat Mivel ezt elvégezhetjük mind a genetikai kód degeneráltságát felhasználva, mind pedig az előzőekben megadott úodalomban [Zuker és Stiegler (1981)] megadott alapokon és módszereket használva, a találmány csak néhány, ha egyáltalán bármiféle limitációnak vethető alá. így a találmány szerinti módszert használva kifejezhetünk gyakorlatilag bármilyen kutatási vagy gyakorlati értékű polipeptidet leúó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát. A találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk szekvenciák beépítésére, és ezzel az egyébként nem stabil ribonukleinsav stabilizálásra, vagy a riboszómához való kötődést és a húvivő ribonukleinsav transzlációjának megkezdését befolyásoló szekvenciák eltávolítására vagy kicserélésére. A találmány szerinti vektorokat és módszert több mikroorganizmussal használhatjuk, például gram-negatív festődésű prokarióta mikroorganizmusokkal, például Escherichia coli-val, például E. coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12 HB101, E. coli K12, C600, E. coli K12 C600 Rk-Mk-, E. coli K12 RR1 és E. coli K12 MM294 mikroorganizmusokkal, Serratia, Pseudomonas és más mikroorganizmusokkal; gram-pozitív festődésű prokarióta mikroorganizmusokkal, például az alábbiakkal: Bacillus, például B. subtilis, B. thuringiensis vagy B. thuringiensis var. israelensis, továbbá Streptomyces, például S. fradiae, S. ambofaciens, S. lividans és S. griseofuscus. Bár a találmány összes kiviteli módja használható, egyes vektorok és transzformánsok előnyösek. Előnyös vektorok a következők: pCZ114, pCZIOl.l, pCZ105.1, pCZ 105.2, pCZlOő.1, pCZ112.1, pCZ112.2 és pCZ1140, előnyös transzformánsok például a következők: E. coli K12 RV308/pCZ114, E. coli K12 RV308/pCZ101.1, E. coli K12 RV308/pCZ105.1, E. coli K12 RV308/pCZ106.1, E. coli K12 RV308/pCZ112.1 és E. coli K12 RV308/pCZU40. Az előnyös csoporton belül a pCZ114 és pCZIOl.l plazmidok és az E. coli K12 RV308/pCZl 14 és E. coli K12 RV308/pCZ101.1 transzformánsok különösen előnyösek. A témában jártasak felismerik, hogy a találmány szerinti vektorok és módszer használható megfelelő gazdasejtek transzformálására úgy, hogy standard fermentációs körülmények között kifejeződjön egy külső eredetű fehérjetermék. Az exogén protein termék ezután a kapott fermentléből ismert módszerekkel izolálható. Az alábbi példákban tovább szemléltetjük a találmány szerinti eljárást Mind az aktuális eljárást, mind annak magyarázatát megadjuk a megfelelő helyen. A példákban a DNS centrifugálását 5 percen át 5 'C hőmérsékleten és 15 000/perc fordulaton végezzük. A teljes sejteket 15 percig, 5 *C hőmérsékleten, 5000/perc fordulatszámmal centrifugáltuk. 1. példa A pNM789B plazmid előállítása A) A pKEN021 plazmidés ennekXbal-BamHIfragmensének előállítása Kiindulási anyagként a pKEN021 (lásd a 3. ábrán: 106) 5,1 kb nagyságú Xbal-BamHI restrikciós fragmensét használjuk. A pKEN021 plazmid a pKENlll származéka [lásd az 1. ábrán: 101, továbbá Lee és munkatársai, J. Bact, 146, 861-866 (1981) és Zwiebel és munkatársai, J. Bact, 145, 654-656 (1981)], amely plazmid az E. coli CC620 törzsből izolálható (letéti szám: NRRL 15 011), és amely 2,8 kb nagyságú frag-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
