202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
13 HU 202 587 B 14 mensén hordozza az E. coli lipoprotein génjét. A fragmens leírását Nakamura és Inouye adja meg [Cell, 18, 1109-1117 (1979)]. A pKEN021 plazmidban az egyetlen EcoRI és Sáli restrikciós helyek közötti 650 bázispár nagyságú szekvenciát (pBR322 plazmid) olyan szekvenciával helyettesítették, amely az E. coli lipoprotein génjét hordozza. A lipoprotein gén szekvenciája [Nakamura és Inoye (1979), lásd előbb] 462 bázispárból álló Alul fragmenst tartalmaz, a lipoprotein gén első tripletjétől (metionin) az 5’-vég felé haladva, és ez tartalmazza apromotert, az 5’-nem transzlatált szakaszt és a riboszóma kötőhelyet. A transzlációs iniciációs metionin szignál előtt 16 bázispárral helyezkedik el a riboszóma kötőhelyen belül az egyetlen Xbal restrikciós hely. Egyetlen PvuII restrikciós helyet találtunk a struktúrgén transzlációs terminációs kodonjától 105 bázispárral balra, ezt BamHI restrikciós hellyé változtatjuk úgy, hogy egy alábbi nukleotid sorrendű, szintetikus dczoxi-ribonukleinsav linkért kapcsolunk hozzá: 5’-CCGGATCCGG-3’. (A linkért az alábbi helyről vásároltuk: Collaborative Research.) A BamHI helyet a lipoprotein utolsó 35 aminosavának kódoló szekvenciája, a transzlációs terminációs jel és a hírvivő ribonukleinsav 3’-nem transzlatált régiójának megfelelő szekvencia követi. A pKEN02l plazmid tartalmaz továbbá egy 850 bázispárból álló, a lipoprotein génnel nem összefüggő szekvenciát, ez az E. coli kromoszómában jobbra helyezkedik el. Ezek a szekvenciák azért vannak jelen, mivel a gén eredeti izolálásakor a módszerek és a rendelkezésre álló restrikciós helyek ilyen eredményt adtak. Az első, második és harmadik ábrán megadott sémából kiderül, hogy a pKEN021 plazmid a pKENl 11 plazmidból származik. Az előállítást az alábbiak szerint végezzük: 50 pg pKENlll (lásd az 1. ábra: 101) dezoxi-ribonukleinsavat 25 egység Hpall restrikciós enzimmel kezelünk 300 pl alábbi összetételű pufferban: 20 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, 10 mmól/1 magnézium-diklorid és 6 mmól/1 -merkapto-etanol. A reakciót 2 órán át végezzük 37 "C hőmérsékleten. Kétszer 300 pl alábbi összetételű eleggyel extrahálunk: fenol-kloroform 50 : 50. A vizes fázist elkülönítjük és 2,5 térfogat etanollal és 0,1 térfogat 3 mólos nátriumacetát-oldattal kicsapjuk. A kivált dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl elektroforetikus pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk (a gélen végzett munkák során az akril-amid és a bisz aránya: 29 : 1, kivéve, ha másként nem jelezzük). A gélt 0,5 pg/ml etidium-bromiddal festjük, és a csíkokat hosszú hullámhosszú ultraibolya fényben vizsgáljuk. A gélről elcktroelúcióval 950 bázispárból álló csíkot izolálunk dialitikus zsákba. A dezoxi-ribonuklcinsavat fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd ezután 2,5 pg-nyi terméket 25 pl alábbi összetételű TEN-oldatban oldjuk: 10 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4 és 1 mmól/1 nátrium-etilén-dinitrilo-tetraecetsav (EDTA), pH = 8,0. 2 pg mennyiségű, 950 bázispárból álló Hpall fragmenst Alul restrikciós enzimmel kezelünk 200 pl alábbi összetételű elegyben: 50 mmól/1 nátrium-klorid, 6 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,6, 6 mmól/1 magnézium-diklorid és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. A reakciót 2 órán át 37 'C hőmérsékleten végezzük. Ezután 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, és a keletkezett 462 bázispárból álló Alul fragmenst az előzőekben megadottak szerint különítjük el és tisztítjuk. 1 pg 462 bázispárból álló Alul fragmenst 10 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldunk, aminek összetétele a következő: 66 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,6, 10 mmól/1 magnézium-diklorid, 10 mmól/1 ditio-treitol, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfát. Az elegy 150 pmól foszforilezett EcoRI linkért is tartalmaz (5’-GGAATTCC-3’; Collaborative Research), továbbá 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt. 16 órán át 4 °C-on inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 65 °C-on tartjuk 10 percen át, és ezután 100 pl-re hígítjuk, az alábbi összetételű EcoRI pufferral: 100 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,2, 50 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 magnézium-diklorid, 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. Az elegyhez 40 egység EcoRI enzimet adunk, majd 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk a mintát, etanollal kicsapjuk. A kivált dezoxi-ribonuklcinsavat 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, a puffert 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal és 0,1 pl pBR322 (1. ábra: 102) dezoxi-ribonukleinsavval egészítjük ki. A ribonukleinsavat EcoRI enzimmel linearizáljuk, és ezután alkalikus foszfatázzal kezeljük. 4 ”C hőmérsékleten 16 órán át ligálunk, majd a kapott dezoxi-ribonukleinsavval ismert módon E. coli K12 HB101 törzset transzformálunk. A transzformánsokat 12 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar lemezeken szelektáljuk, és a plazmidokat a rezisztens telepekből a gyors alkalikus extrakcióval izoláljuk. [Bimbóim és Doly, Nucleic Acids. Research, 7, 1513-1523 (1979).] így 466 bázispárból álló Xbal-BamHI fragmenst tartalmazó plazmidot (1. ábra: 103) kapunk, a következő lépésben ezt használjuk kiindulási anyagként. 2 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat (2. ábra: 103) 2 egység Hindin enzimmel kezelünk 50 pl alábbi öszszetételű reakcióelegyben: 60 mmól/1 nátrium-klorid, 10 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, 10 mmól/1 magnézium-diklorid és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. A reakciót 1 órán át 37 ‘C hőmérsékleten végezzük. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, a kicsapott terméket 200 pl alábbi összetételű pufferban oldjuk: 300 mmól/1 nátrium-klorid, 30 mmól/1 nátrium-acetát, pH = 4,25, 1 mmól/1 cink-diklorid és 200 egység SÍ nukleáz [Miles Laboratories]. 1 órán át 15 *C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a reakció leállítására fenol és kloroform elegyével extraháljuk, és etanollal kicsapjuk a terméket. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl T4 dezoxi-ribo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
