202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
9 HU 202 586 B 10 ban az infúzió sebessége és az urokináz koncentrációja jelentősen változni fog, a választott urokináz származék aktivitásától, a beteg általános állapotától, például a vérrög kiterjedésétől és a beteg hemosztatikus állapotától, és az adagolás módjától (például koronáriás katéter vagy perifériás adagolás) függően. Az alkalmas urokináz koncentrációk és adagolási sebesség meghatározása a mindenkori gyakorló orvos feladata. Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti urokináz speciesek esetében tapasztalt gyakorlatilag melléktünetmentesség nagyobb dózisok és adagolási sebességek alkalmazását teszi lehetővé, mint a korábban, a kettős szálú urokinázzal kapcsolatban megszokott értékek. 1. példa A Lysi35 deléciós mutáns konstrukciója Kiindulási plazmidként pUK54trp207*TX plazmidot használunk. Ez a plazmid a teljes HŰK gént kódoló DNS-t tartalmazza, E. coli up promoter kontrollja alatt. Ez a plazmid azonos a pUK54trp207-l plazmiddal (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés), azzal az eltéréssel, hogy csak egy EcoRI helyet tartalmaz, a trp promoter 3’ végéhez közel és nem tartalmazza a pBR322 vektor-komponens Aval és PvuII helyei közötti 641 bp hosszúságú szakaszát, mert ezt delécióval eltávolították (úgynevezett „XAP” deléció) (Sutcliff, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 43: 77 1979). ApUK54trp207-l*TX plazmid ismert eljárással készül, (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés), azzal az eltéréssel, hogy kiindulási plazmidként pHGH207-l helyett pHGH207-l*XAP-t használunk. A pHGH207- 1*XAP a pHGH207-l részleges emésztésével - a plazmid felnyitására -, a kohéziós végeknek a DNS polimeráz I Klenow fragmentumával végzett feltöltésével, a plazmid T4 ligázzal történő decirkularizálásával készült, majd a kapott plazmiddal E. colit transzformáltunk. Szelekcióval egy olyan plazmidot, a pHGH207- l*-et választottunk ki, amelyben restrikciós enzim analízissel meghatározva csak a trp promoter 3’ végén lévő EcoRI hely maradt meg. Az XAP deléció végrehajtása céljából a pHGH207- l*-et Aval-gyel és PvuII-vel emésztjük, a nagy vektorfragmentumot kinyerjük, a kohézis végeket Klenow fragmentummal feltöltjük, a plazmid tompa végét T4 ligázzal ligáljuk, és a ligálási elcggyel E. colit transzformálunk. A pHGH207-l*XAP-t kinyerjük és ismert módon pUK54trp207*TX-et állítunk elő belőle. A pUK54trp207-l *TX-et Pstl-el és BclI-gyel emésztjük és a körülbelül a 439-732 bázisokat felölelő fragmentumot kinyerjük. A kettős szálú M13mpl0-et (ekvivalens M13mpl8 fág a kereskedelemben a Bethesda Research Laboratories-től szerezhető be) Pstl-gyel és BamHI-gyel emésztünk, és a Pstl-Bcll urokináz DNS fragmentumhoz ligáljuk, ily módon M13mpl0UKl-et hozva létre. Az E. coli JM101 sejteket (ATCC 3387 6) az M13mpOUKl kettős szálú replikatív formájával (RF) transzformáljuk. Az egyes szálú és RF M13mpl0UKl-et a fertőzött E. coli JM101 sejtekből ismert módon izoláljuk. A Bell és BamHI kohéziós végeket alkot, így az M13mpl0 fág alkalmas az urokináz inszertummal történő recirkularizálásra. Az egyes szálú formált urokináz hely specifikus mutagenezisére használjuk, a Lys136 helyen. A szintetikus oligonukleotidot a szilárd fázisú foszfotriészter módszerrel (Crea et al. „Proc. Nat Acad. Sei. USA” 75: 5765 1978) készítjük mutagenezis printerként történő felhasználásra. A Lys136 deléciójához a következő prímért használjuk: 5 ’pGC AG ATGG A A A ACCCTCCTCTCCT 530 556 Ez az urokináznak az a része, amely a Lys136-tan szomszédos szálat kódolja, azzal az eltéréssel, hogy a Lys13tnak megfelelő AAG kodont eltávolítottuk. A következőkben leírt eljárást használtuk egy a szintetikus primerek mutált szekvenciáját tartalmazó urokináz klón kialakítására. Ez az eljárás önmagában ismert [Adelman, J. et al. In Vitro Deletional Mutagenesis for Bacterial Production of the 20 000-Dalton Form of Human Pituitary Growth Hormone „DNA” 2(3): 183— 193 1983]. 50 ng szintetikus oligonukleotidot 30 percen át 37 °C-on foszforilezünk, 10 pl olyan elegyben, amely 50 mmól Tris-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 MgCl2-ot, 10 mmól/1 ditiotreitolt, 1 mmól/1 ATP-t, valamint 8 E T4 polinukleotid kinázt tartalmaz. A hidrolizációs próbaként történő felhasználásra 400 ng szintetikus oligonukleotidot a fenti módon foszforilezünk, azzal az eltéréssel, hogy az ATP helyett 60 mCi (32p)-ATP-t (3000 Ci/mmól) használunk, amely körülbelül 50-60 x 106 cpm/400 ng 24mcr-t eredményez. A heteropudle létrehozásához 100 ng egyes szálú M13mpOUKl-et 10 perc alatt 95 “C-ra melegítünk, majd 30 perc alatt lassan szobahőmérsékletre hűtjük, 40 pl olyan elegyben, amely 10 mmól/1 Tris-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 MgCl2-t, 1 mmól/1 ditiotreitolt és 10 ng foszforilezett prímért tartalmaz, 500 ng EcoRI-emésztett M13mpl0UKl nagy fragmentum mellett. A primer extenziót 10 pl olyan puffer hozzáadásával indítjuk, amely 50 mmól/1 Tris-HCl-t (ph 7,5), 10 mmól MgCl2-t és 1 mmól ditiotreitolt, valamint 2 mmól/1 ATP-t tartalmaz, egyenként 0,25 mmól dGTP, dTTP, dCTP és dATP, 5 E E. coli DNS polimeráz I nagy fragmentum és 400 E T4 DNS ligáz mellett. Egy órás 12 ‘C-on végzett kezelés után a reakcióelegyet E. coli JM101 sejtek transzformálására használjuk. A transzformálást úgy végezzük, hogy 10 pl ligációs elegyet elkeverünk 200 pl kompetens JM101 sejttel, majd 30 percen át jégen és 5 percen át 37 ’C-on inkubálást végzünk. Ezután 55 'C-on 3,5 ml 2YT fedő agart elkeverünk 300 pl telített JM101 sejttel, 10 pl IPTG-vel (200 mmól) és 50 pl Xgal-lal, majd a transzformált sejtek hozzáadása után az elegyet 9 cm átmérőjű, gyógyszer nélküli LB-t tartalmazó Petri-csészékbe helyezzük. Két színtelen plaque-ot (B2 és G12) választunk ki és átvisszük egy 100 pl 2YT táptalajt tartalmazó mikrotiter edénybe. Az inokulált mikrotiter folyadékokat 15 cm átmérőjű LB agar lemezekre helyeztük, amelyeket 600 pl JM101 sejt 8 ml 2YT fedő agarral készített elegyével rétegzünk felül, és az egészet egy éjszakán át 37 ‘C-on inkubáljuk. A keletkezett plaque-okat 1 percig tartó fizikai kontaktussal átvisszük egy nilrocellulóz lemezre. A nilrocellulóz lemezt 0,5 mól/1 nátrium-hidroxidot és 1,5 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldattal kezeljük 3 percig, majd kétszer, 15 percig 3 mól/I nátrium-klorid és 0,5 mól/1 Tris-HCl-t (pH 7,5) tartalmazó oldattal, majd újabb 15 percig 2X SSC-vel mossuk. A prehibridizációs elegy 10 mmól/1 Tris-t (ph 7,5) 5 mmól/1 EDTA-t, 0,9 mól nátrium-kloridot, IX Den-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
