202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
11 HU 202 586 B 12 hardt-ot 0,5% NP40-et, 100 pmól/1 ATP-t, 1 mmól/1 nátrium-pirofoszfátot, 1 mmól/1 nátrium-foszfátot és 50 (ig/ml E. coli tRNS-t tartalmaz. Az IX Denhardt elegy literenként 200 g Ficollt, 200 mg poli/vinil-pirrolidon/-t, 200 mg szarvasmarhaszérum albumint (BSA, V frakció) tartalmaz. A lemezt vákuumban, 90 percen át 80 ’C-on hókezeljük. Ezután 3 órán át, Petri-csészében 6 ml prehibridizációs folyadékkal inkubáljuk, majd hozzáadunk 5 x 10® cpm jelzett prímért és a hibridizálást egy éjszakán át folytatjuk. A lemez szelektív mosását 0,4X SSc-vel 49 "C-on hajtjuk végre, és szárítás után a lemezről röntgenfelvételt készítünk. A pozitiven hibridizáló kiónokat didezoxi-szekvenálással tovább analizáljuk. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a B2 klón tartalmazta a Lys136 deléciót tartalmazó helyes szekvenciát. Az expressziós plazmid újbóli felépítése úgy történik, hogy a pUK54trp207-l *TX-ből származó Xbal- BcII és Xbal-PstI fragmentumokat a B2 plaque-ból származó Sau3A-PstI-bciktató fragmentummal ligáljuk, és a ligálási elegyet E. coli-ba transzformáljuk. Kiválasztunk egy olyan transzformánst, amely egy a mutáns gént hordozó plazmidot (pUK54B2) tartalmaz. A fragmentumokat szokásos restrikciós enzim emésztéssel és a kívánt fragmentumok kinyerésével készítjük. Míg eközen mind a Bell, mind a BamHI helyek elvesznek, az Ml 3 urokináz inszertum kivágása ugyanazon a helyen történik, mint a Bell és BamHI ligálása a Sau3A-val, amely felismeri a Bell, BamHI vagy BclIBamHI ligációs helyek bármelyikének központi négy bázisát. Az E. coli transzformálásához pUK54B2-t használunk. Jelenleg a W3110fhuA -t tartjuk előnyös E. coli törzsnek. Ez a törzs nem lényegbevágó a találmány szerinti urokináz mutánsok előállítása szempontjából, de alkalmazása kényelmes, mert kellőképpen rezisztens a szennyező fágokkal szemben, és így a kereskedelmi mennyiségű termék szintézise szempontjából praktikusan használható. Az E. coli W3110 fhuA - egy TI fág rezisztens baktérium, amelyet az jellemez, hogy az fhuA génnel kapcsolatos DNS szekvenciákban egy deléciót vagy inverziót tartalmaz. Röviden, az E. coli W3110-et (ATCC 27325) transzdukáljuk lambda-baktriofággal, amely a tetraciklin-rezisztenciát biztosító TnlO transzpozálható elemet tartalmazza. A TnlO-zel transzdukált W3110 törzseket a fág-infekcióval szemben mutatott rezisztenciájuk alapján szelektáljuk. A fág-rezisztens törzseket összegyűjtjük, és a Pl bakteriofággal fertőzzük. A kapott lizátumot használjuk az E. coli AT982 (Bukhari et al. J. Bacteriology” 705:844 1971) transzdukálására. Az AT982 törzs egy DAP mutációt tartalmaz, az fhuA génhez közeli helyen. Ennek megfelelően, az AT982 törzs átalakítására (transzdukciója) a Pl lizátummal és az olyan transzduktánsok szelekciója, amelyek tetraciklin-rezisztensek és amelyek a DAP funkciót regenerálják, arra utalnak, hogy a Tn 10 transzpozon a fhuA génen belül helyezkedik el. Azok a törzsek, amelyek tetraciklin-rezisztensek és regenerált DAP funkciót mutatnak a forrásai az E. coli W3110 Pl baktérium fággal végzett transzdukciójához szükséges DNS-nek. Szelekcióval kiválasztjuk a tetraciklin-rezisztenciát és fág rezisztenciát kifejező transzdukált W3110 törzseket. Ezeket a törzseket azután a fág infekcióval szembeni rezisztencia és a tetraciklin-érzékenynyé történő átalakulás alapján szelektáljuk (Naloy et al. ,J. Bacteriology” 745:1110 1981). A tetracikün-érzékenység visszatérése a TI fág infekcióval szembeni rezisztencia megtartásával kombinálva azt mutatja, hogy az fhuA génnel kapcsolatos DNS szekvencia vagy hiányzik, vagy irreverzibilisen invertálódott. Az így konstruált törzseket E. coli W3110 fhuA~-nak nevezzük. A TnlO kicserélhető elemet tartalmzó fágot, amelyet a TnlO-nak a W3110-be történő inszertálására használunk, a következőképpen állítjuk elő: A kiindulási anyag a lambda cl857b 2210am29. Ez a fág az irodalomból ismert (Kleckneretal. ,J. Mól. Bioi.” 776:1241977), és a lambda fág három jól ismert mutánsából standard eljárásokkal készült. E lambda fág lizátumát az E. coli C600 (ATCC 23724) szupresszoron készítjük el, amelyet olyan, a területen jártas szakember számára ismert módszerekkel manipulálunk, amelyek biztosítják, hogy a TnlO transzpozont is hordozza (Kleckner et al. J. Mól. Bioi 776: 125 1977). Ezt a lizátumot használjuk egy amber szupresszort és egy cl857 genotípust hordozó E. coli C600 (ATCC 23724) fertőzésére. A tetraciklin rezisztens kolóniák lizátumait hőindukcióval készítjük, a tetraciklin-rezisztens telepeket először folyékony táptalajban 32 "C-on, majd 42 *C- on 90 percig inkubálva. A lizátumot ezután E. coli C600-ra rétegezzük, majd replikát készítünk. Az E. coli C600-on megjelenő plaque-okat 32 "C-on E. coli C600- on és E. coli W3102 sup*-on (lambda imm434) replikáljuk, mely utóbbi lambda a imm434 heteroimmun profágot tartalmazza (Kleckner et al. „Genetics” 90: 427 1978). A heteroimmun törzsön megjelenő plaque-okat tetraciklin lemezekre helyezzük. Az ezeken a lemezeken megjelenő plaque-ok alkalmasak a tetraciklin rezisztencia transzdukálására, és a fenti eljárással ezeket használjuk az E. coli W3110 fhuA' kialakítására. A rekombináns natív és (Lys13< ->A) humán urokinázt 1 liter W/3110 vagy W31 lOFhuA' sejttenyészetből kapjuk, amelyet az alkalmas plazmiddal transzformáltunk. Az expressziót indol-akrilsav hozzáadásával indukáljuk. 2. példa A (LySi3í->A; Pheij7Lys1S!-»A) humán urokináz konstruálása A más vagy további mutánsokat is tartalmazó expressziós plazmidok kialakítása során lényegében az 1. példában ismertetett eljárást követjük. Néhány eseben célszerű olyan M13 fágot használni, amely már egy vagy több mutánst tartalmaz a további helyeken mutált DNS előállítása során. A cím szerinti humán urokináz előállítása a következő eljárással történik. Templátként az M13mpl0UKl-et használjuk, a következő szekvenciájú printerrel kombinálva: 5’pCTGAGGCCCCGCATTATTGGGGGA 593 621 A fentiekben ismertetett eljárást használva azonosítjuk a 2F3 plaque-ok A 2F3 plaque-ból származó fág egy a Pheij7 Lys15g-»A mutációt tartalmazó urokináz DNS fragmentumot tartalmaz. Az ezt a mutációt és ezen felül a Lysi» deléciós mutációt (1. példa) tartalmazó expressziós plazmidot úgy hozzuk létre, hogy a pUK54B2 Ball-BclI emésztésével kapott vektor fragmentumot a 2F3 fág BalI-Sau3A inszerciós fragmentumával Egáljuk, és E. coli W3110-et vagy W3110FhuA-t transzfor5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
