202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
7 HU 221 585 B 8 coli K12 294 egy Rk MU sejt, a plazm id dezoxi-ribonukleinsav EcoK-specificitás alapján metilezéssel izolálható. 5 pl, 0,1 pg dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot SSC/10-oIdalban (15 mM nátrium-klorid és 1.5 mM trinátrium-citrát, pH = 7) 50 pl-re hígítunk. Ezután 25 pl puffcr-dezoxi-ribonukleinsav-oldatot 50 pl E. coli K12 C600Rk“Mk~ sejtszuszpenzióval keverünk. Ismert módon E. coli K12 C600RifMk~ [Chang és Cohen, Proc, Nat. Acad, Sei., USA, 77, ,1030 (1974)] kompetens sejtszuszpenziót készítünk. Úgy járunk el, hogy L-táptalajban [Mikler, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972)] készült friss, egy éjszakán át növesztett tenyészetet 1 : 9 arányban hígítjuk friss L- táptalajjal, és egy órán át 37 *C hőmérsékleten tovább növesztjük. 6,6 x 107 sejt/ml a tenyészet sűrűsége, amikor a sejteket összegyűjtjük, 2,5 ml, 1Ö0 mmólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, 2,5 ml, 150 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és 20 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Összegyűjtjük a sejteket, 0,5 ml alábbi összetételű oldatban szuszpendáljuk: 150 mM kalcium-klorid és 10% glicerin. 3-5 percen át jégfürdőben hűtjük, cs ezután fagyasztjuk. A fagyasztott kompetens sejtszuszpenziót használatig folyékony nitrogén alatt tartjuk. Az előkészület és a tárolás nem csökkenti a sejtek élőképességét vagy a kovalensen zárt, kör alakú plazmid dezoxi-ribonukleinsavval végzett transzformáció frekvenciáját. Jégfürdőben felolvasztjuk a sejtszuszpenziót és 0,5 térfogat dezoxi-ribonukleinsav-oldattal keverjük, transzformáció céljából. A transzformációs clcgyet jégfürdőben 20 percen át hűtjük, majd 1 percen át 42 °C hőmérsékleten hősokkot végzünk, és ezután 10 percen ál jégfürdőben ismét hűljük. Ezután 5,7 térfogat L-táptalajjal hígítjuk a szuszpenziót, és 90 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A transzformánsok izolálására a tenyészetet 12.5 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agaron növesztjük. Az izolátumok telraciklin-rcziszlcnciáját ellenőrizzük és megállapítjuk ampicillin-érzékenységükct, amiután megkapjuk az előállítani kívánt E. coli K12 C600Rk~Mk_ /pDIlO transzformánsokat. A megfelelő telepekből kovalensen zárt kör alakú dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, Bazaral és Hclinski 1968-ban leírt módszere szerint eljárva. A plazmid szerkezetét restrikciós helyeinek térképezésével bizonyítjuk. 2. példa A pl A 7A4 A1 plazmid előállítása A) A pBRIItrp plazmid előállítása ApGMl plazmid hordozza a ALE1413 delóciót tartalmazó E. coli triptofán operont [Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1457-1466 (1978)], és ezért olyan fúziós proteint fejez ki, amely áll a trp vezető szakasz első 6 aminosavából és a trp E polipcplid körülbelül utolsó egyharmad részéből (a továbbiakban LE’ jellel jelöljük), továbbá kifejezi a trp D polipcptidet teljes egészében, és mindezt a trp promoter-operator rendszer szabályozása alatt. Az E. coli K12 W311- Otna2trpA102/pGMl törzs az American Type Culture Collection-ban van letétbe helyezve (ATCC 31622). A sejtekből a pGMl hagyományos módon izolálható. 20 pig plazmidot PvuII restrikciós enzimmel emésztünk, az enzim a plazmidot öt helyen hasítja. A génfragmenseket EcoRI linkerekkel kapcsoljuk (ez önmagukkal komplementer, alábbi szekvenciájú oligo-nukleotid: pCATGAATTCATG), így olyan EcoRI hasítási helyet biztosítunk amely a későbbiekben felhasználható EcoRI helyet tartalmazó plazmidba való, klónozáshoz. A pGMl plazm idból kapott 20 pg mennyiségű dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 10 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 200 pikomól 5’-foszforilezett, szintetikus pCATGAATTGATG oligonukleotid jelenlétében, 20 pl T4 dczoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban. A puffer összetétele a következő: 20 mM trisz, pH = 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM diiio-treitol. A reakciót egy éjszakán át végezzük 4 °C hőmérsékleten. Ezután 10 percen át 70 "C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, a ligálás befejezésére. A linkereket EcoRI emésztéssel hasítjuk, és az EcoRI végekkel rendelkező fragmenseket 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve elkülönítjük. A három legnagyobb fragmenst izoláljuk a gélről oly módon, hogy először etidium-bromiddal festjük, és azután ultraibolya fénnyel lokalizáljuk a fragmensek helyeit. Innen kivágjuk a gélt. A géldarabokat 300 pl, 0,1 x TBE-oldatlal dialízis-zsákokba helyezzük, és 1 órán át 0,1 x TBE-oldatban 100V feszültség mellett elektroforézist végzünk. A TBE-puffer 10,8 g trisz-bázist, 5,5 g bórsavat, 0,09 g dinálrium-ctilén-diamin-tctraecetsavat tartalmaz Lenként. A dialízis-zsákból összegyűjtjük a vizes oldatot, fenollal, majd kloroformmal extraháljuk, és nátrium-klorid töménységéi 0,2 mólra állítjuk be. Ezután etanolos kicsapással elkülönítjük a dezoxi-ribonukleinsavat. Az EcoRI ragadós végekkel rendelkező, trp promoteroperator rendszert tartalmazó gént az alábbiakban megadott módon azonosítjuk. Úgy járunk el, hogy a fragmenseket tetraciklin-érzékeny plazmidba építjük be, amelyek a promoter-operator rendszer beépülését követően tctraciklin-rczisztenciát fognak meghatározni. A továbbiakban megadott összes dezoxi-ribonuklcinsav-fragmens izolálást poliakril-amid gél-elektroforézist követő clcktroelucióval végezzük, ahogy azt az előzőekben megadtuk. B) A trp promoter-operator rendszer szabályozása alatt tetraciklin rezisztenciái kifejező pBRH trp plazmid előállítása és az A) pontban megadottak szerint izolált trp promoter-operatort tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmens azonosítása és sokszorosítása A pBRHl plazmid [Rodriguez és munkatársai, Nucleic Acids Research, 6, 3267-3287 (1979)] ampicillinreziszlenciát fejez ki, és tartalmazza a tetraciklin-rezisztenciát meghatározó gént, azonban - mivel ez promoterrel nincs kapcsolatban - a rezisztenciát nem fejezi ki. A plazmid így tetraciklin-érzékeny. Az EcoRI helyre promoter-operator rendszert beépítve a plazmid tclraciklin-rezisztenssé tehető. A pBRHl plazmidot EcoRI enzimmel emésztjük. Az enzimet fenolos extrakcióval távolítjuk el, majd kloroformos extrakciót követően a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük cl. A kapott dezoxi-ribonuklcinsav-molekulát egy másik reakcióelcgyben az előzőekben a 2A) példa szerint előállított három dezoxi-ribonuklcinsav-fragmens mindegyikével keverjük, és az előzőekben megadottak szerint T4 dczoxi-ribonuklein-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
