202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
9 HU 202 585 B 10 sav-ligázzal ligáljuk. A reakcióelegyben jelenlévő dezoxi-ribonukleinsavval ismert módon [Hershfield és munkatársai, Proc, NaL Acad, Sei., US A, 71,3455-3459 (1974)] E. coli K12 294 kompetens sejteket transzformálunk, és a baktériumokat LB-lemezeken [Miller (1972)] szélesztjük, a táptalajba előzőleg 20 pg/ml ampicillint és 5 pg/ml tetraciklint adagolunk. Több tetraciklin-rezisztens telepet szelektálunk, és ezekből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és ezt pBRHtrp jellel jelöljük. Az adott fragmens jelenlétét restrikciós enzimmel végzett analízissel bizonyítjuk. A pBRHtrp plazmid ß-laktamäz enzimet fejez ki, az ampicillin rezisztenciát kódol. A plazmid tartalmazza a trp promoter-operator rendszert hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmens meghatároz továbbá egy első fehérjét (ezt LE’ jellel jelöljük), amely a üp vezetőrész első 6 aminosavának és a trp E polipcptid körülbelül utolsó harmadának fúziójából jön létre. Meghatároz a fragmens továbbá egy D’jellel jelzett második proteint is, ez megfelel a trp D polipeptid körülbelül első felének. A meghatározott harmadik protein a tetraciklin-rezisztencia gén által kódolt C) A pSOM7A2 plazmid előállítása A pBRHtrp plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott fragmenst poliakril-amid gélelektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk. Az izolált fragmenst EcoRI enzimmel emésztett pSOMll plazmid [Itakuraés munkatársai, Sei., 198,1056(1977); brit szabadalmi leírás, 2 007 676A] fragmensekkel keverjük. Az elegye! T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal ligáljuk, és a kapott dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K12 294 sejteket transzformálunk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A transzformáns baktériumokat ampicillint tartalmazó táptalajon szelektáljuk, és az így kapott ampicillinre rezisztens telepeket telephibridizációval vizsgáljuk [Gruenstein és munkatársai, Proc, Nat. Acad. Sei., USA 72, 3951-3965 (1975)]. A fenti kísérletben próbaként a pBRHtrp plazmidból izolált, és ezután P32-vel radioaktívan jelzett trp promoter-operatort tartalmazó fragmenst használjuk. A telephibridizáció során több telep pozitív reakciót adott, és így szelektáljuk ezeket. Izoláljuk a plazmid dezoxi-ribomíklcinsavat, és a beépült fragmensek orientációját restrikciós analízissel meghatározzuk, az analízist BglII és BamHI enzimekkel végezzük, kettős emésztést használva. Az adott plazmidot tartalmazó telepeket, amelyek megfelelő orientációban hordozzák a trp promoter-operator fragmenst, LB-táptalajban [Miller (1972)] növesztjük, 10 pg/ml ampicillin jelenlétében. A plazmidot pSOM7A2 jellel jelöljük, és az alábbi kísérletekben felhasználjuk. D) A pTrp24 plazmid előállítása 1. Az LE' polipeptid távolabbi régióit meghatározó kodonokat tartalmazó és a kódoló szál 5’-illetve 3’-végein BglII, illetve EcoRI restrikciós helyet hordozó génfragmens előállítása ' A pSOM7A2 plazmidot HindlII enzimmel, majd ezután lambda exonukleázzal (5’-3’-cxonukleáz) kezeljük, olyan körülmények között, hogy az emésztés az LE’-t meghatározó régió BglII restrikciós helye mentén történjen. 20 [tg HindlII enzimmel emésztett pSOM7A2 plazmidot 20 mmól glicin-puffer, pH = 9,6,1 mM magnézium-kloridot és 1 mM ß-merkapto-etanolt tartalmazó elegyben oldunk. A kapott elegyet 5 egység lambda exonukleázzal kezeljük 60 percen át, szobahőmérsékleten. A kapott reakcióelcgyet fenollal, majd kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Az LE’ génfragmens távolabbi végén EcoRI vég előállítására továbbfejlesztett foszfo-triészter-módszerrel [Crea és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 75, 5765 (1978)] előállítjuk az alábbi prímért; P32CCTGTGC ATG AT. ezt az exonukleázos emésztés után kapott LE’ génfragmens egyszálú végéhez hibridizáljuk. A hibridizációt úgy végezzük, hogy 20 pg lambda exonukleázzal kezelt, HindlII enzimmel emésztett pSOM7A2 plazmid fragmenst 20 pl vízben oldunk, és 6 pl, 80 pikomól 5’-foszforilezett, fentiekben megadott oligonukleotidot tartalmazó oldattal keveijük. A szintetikus fragmenst az LE’ kódoló szekvencia 3’-végéhez hibridizáljuk, és a megmaradó, az LE’ fragmensen lévő egyszálú szakaszt Klenow polimeráz I enzimmel töltjük fel dATP, dTTP, dGTP és dCTP jelenlétében. A Klenow polimeráz I a dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I proteolitikus emésztésével kapott enzim. 5’-3’ polimerizációs aktivitással rendelkezik, továbbá rendelkezik 3’-5’ exonukleolitikus aktivitással, hiányzik azonban az eredeti enzim 5’-3’ exonukleolitikus aktivitása [Komberg (1974), Freeman és Co., SFO, 98]. 50 °C hőmérsékletre melegítjük az elegyet, és lassan 10 °C-ra hűtjük, amiután 4 pl Klenow enzimet adagolunk. 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd az inkubációt 30 percen át 37 *C hőmérsékleten folytatjuk. A reakciót 5 pl, 0,25 mólos etiléndiamin-tetraecetsav-oldat adagolásával állítjuk le. Fenollal, majd kloroformmal extraháljuk a reakcióelcgyet, és etanollal kicsapjuk. Az izolált dezoxi-ribonukleinsavat BglII restrikciós enzimmel hasítjuk, és a fragmenseket poliakril-amid gél-elektroforézissel elkülönítjük. A várt, 470 bázispárból álló P32-jclzett fragmens jelenléte révén autoradiogrammot kaptunk. A fragmenst elektroelucióval izoláljuk. Ahogy azt kifejtettük, ez az LE’ (d) fragmens BG1II véggel és egy olyan tompa véggel rendelkezik, amely az adott primerrel kezdődik. 2. A pTIIcü plazmid előállítása A pTHal plazmid előállítására a thimozin-a-1 szintetikus gént beépítjük a pBR322 plazmidba. A thimozinal fehérjét kódoló dezoxi-ribonukleinsav szintézise magában foglalja 16 oligonukleotid (TrT16) szintézisét és ligálását, ahogy azt a mellékelt 7. ábrán a két fejjel jelzett nyilak mutatják. Az N-terminális végre metionin kodont (ATG) kapcsolunk, és az 5’-végeket egyszálú kohéziv végekké alakítjuk abból a célból, hogy EcoRI és BamHI enzimekkel hasított plazmidhoz kapcsolhassuk. Ahogy az könnyen belátható, a gén közepén elhelyezkedő BglII hely elősegíti a rckombináns plazmidok analízisét. A T,-T16 oligo-dezoxi-ribonukleotidokat módosított foszfo-triészter-módszerrel állítjuk elő, teljesen védett tridezoxi-ribonukleotid építőköveket használva [Ilakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977) és Crea és munkatársai (1978)]. A különböző oligo-dezoxi-ribonukleotidokat az alábbi I. táblázatban mutatjuk be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
