202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
5 HU 202 585 B 6 A baktériumok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen a találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint Hhall specificitású, plazmidon levő restrikciós és modifikációs géneket használunk. Használhatunk más specificitású restrikciós-modifikációs rendszert meghatározó géneket is. Ezek például a következők: PstI restrikciós-modifikációs rendszer (Wälder és munkatársai, Proc, Natl. Acad. Sei., USA, 78 (3), 1503, 1981); EcoRI restrikciós-modifikációs rendszer (Jack és munkatársai, Fed, Proc, Fed. Am. Soc. Exp. Bioi., 39, 1875,1980); vagy a Taql restrikciós-modifikációs rendszer (Lan-Hsiaing és munkatársai, Federation Proc., 41, 5427,1982). A Taql restrikciós-modifikációs rendszer génjeit könnyen klónozhatjuk a Thermus aquaticus YT-1 sejtekből (Brock és Freeze, J. Bacteriology, 98 (1), 289, 1969; típustörzs: ATCC 25104) Mann és munkatársai szerint eljárva (Gene, 3, 97, 1978). Ugyanúgy, ahogy a Hhall restrikciós-modifikációs rendszernél, a modifikációs géneknek a restrikciós gének előtt kell kifejeződniük. A fenti géneket külön-külön vagy a Hhall vagy más, restrikciós-modifikációs rendszerrel kombinálva is felhasználhatjuk a baktériumok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen, így ezek is a találmány oltalmi körén belül esnek. A találmány szerinti módszert a baktériumok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen olyan gazdasejtek esetén is felhasználhatjuk, amelyek egy sor felhasználható terméket kifejező gént hordozó vektort tartalmaznak. Bár a restrikciós-modifikációs géneket egy különálló vektoron is bejuttathatjuk a sejtbe, klónozhatjuk ezeket a géneket egy olyan plazmidba is, amely a felhasználható terméket kifejező gént tartalmaz. Használható polipeptidet kifejező gén lehet természetben előforduló, nem természetes vagy részben természetben előforduló és részben szintetikus vagy nem természetes gén. Részletesebben szólva, a restrikciós-modifikációs rendszer génjeit klónozhatjuk olyan plazmidokba, amelyek tartalmaznak humán pre-proinzulint, humán proinzulint, humán inzulin A-láncot, humán inzulin B-láncot, humán növekedési hormont, nem humán növekedési hormont, marha növekedési hormont, nem humán inzulint, humán interferont, nem humán interferont, vírus antigént, urokinázt, antibiotikum rezisztenciát kialakító enzimet, bármely peptid hormont, bármely peptid enzimet vagy gyakorlatilag bármilyen kutatási vagy gyakorlati értékkel bíró peptidet kifejező gént. A találmány specifikus kivitelezési változatai során a plazmid replikációját és a polipeptid tennék kifejeződését a pMB 1-ből származó polA gént igénylő replikonnal [lásd Bolivar, Life Sei., 25, 807-818 (1979)] és a tip promoterrel határozzuk meg. Más replikonokat és promotereket is használhatunk mindaddig, míg ezek funkcionálnak a védendő egyes baktérium-transzfórmánsokban. A témában jártas szakemberek könnyen meghatározhatják, mely replikonok és promoterek használhatók előnyösen az egyes baktériumokban. A felhasználható egyéb replikonok közül megemlítjük a ColEl, NR1, RK2, RK6, pSClOl, RP1, RP4, F és más, ezekhez hasonló replikonokat, köztük az E. coli K12 sejtekben replikálódni képes bakteriofágokat. Az egyéb felhasználható promoterek például a lambdaPL promoter, a lipoprotein promoter, lac promoter, a riboszóma protein vagy ribonukleinsav promoterek, illetve gyakorlatilag bármely más promoter. A témában jártas szakemberek megértik, hogy a találmány szerinti restrikciós-modifikációs rendszert tartalmazó vektorok előállításakor egy sor replikációs origót és promotert használhatunk fel. Az E. coli baktériumról rendelkezésünkre álló genetikai és biokémiai információk gazdagsága miatt ezt a törzset előnyösen használhatjuk a találmány szerinti eljárás során. Ezenkívül, mivel a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiák segítségével előállított biológiai termékek nagy részét E. coli KI 2 sejtekkel állítják elő, különösen előnyös, ha a találmány szerinti eljárás során ezt a törzset használjuk. Ahogy azt az előzőekben már említettük, az E. coli törzzsel végzett nagy méretű fermentációk során gyakran jelentkezik a fág-fertőzéssel kapcsolatos nehézség. A találmány szerinti eljárással ezt a problémát gyakorlatilag megoldjuk, és így lehetővé válik a bioszintetikus termékek gyakorlati előállítása. Ennek ellenére, a találmány szerinti eljárást nem korlátozzuk egy nemre, fajra vagy törzsre, mivel bármely olyan mikroorganizmusban használhatjuk, amelyekben egy restrikciós-modifikációs rendszer génjei klónozhatok. A találmány szerinti eljárás alkalmazható például általában a prokarióták esetén, részletesebben baktériumoknál, köztül például E. coli, E. coli K12,E. coli K12 294 (lásd Goeddel és munkatársai, Proc. NaL Acad. Sei., USA, 76,106,1979), E. coli K12 RV308 [lásd Mauer és munkatársai, J. Mól. Bioi., 139,147 (1980)], E. coliK12 C600 (lásd Bachman, Bacteriol, Rév., 36, 526 (1972)], E. coli K12 C600Rk-Mk- [lásd Chang és Cohen, Proc, NaL Acad, Sei. USA, 71, 1030 (1974)], E. coli K12 HB101 [Bolivár és munkatársai, Gene, 2,75 (1977)], E. coli K12 BE827 (ATCC 31911), Bacillus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Staphylococcus, Streptococcus, Actinomycetis, Streptomyces, Agrobacterium, Serratia, Pseudomonas vagy bármely más, olyan baktériumsejt esetén, amely érzékeny bakteriofág-fertőzésre, és amelybe restrikciós-modifikációs rendszer klónozható. A találmány szerinti eljárás során klónozó vektorként előnyösen az alábbi plazmidokat használhatjuk: pPR27, pPR28 és pPR29, az előnyös transzformánsok az E. coli K12 RV308/pPR27, az E. coli K12 RV308/pPR28 és az E. coli K12 RV308/pPR29. Ezek, és a találmány szerinti többi kivitelezési változat is azzal a közös jellemzővel bír, hogy alkalmazásával megvédhetjük a baktériumokat a természetben előforduló bakteriofágoktól. így a találmány szerinti eljárással lehetségessé válik a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó mikroorganizmusokkal nagy méretű fermentációs végzése anélkül, hogy jelentős valószínűséggel fágfertőzés, lizis és ennek következtében bioszintetikus kapacitáscsökkenés következzen be. A találmány szerinti eljárást részletesen az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa A pDIlO plazmid izolálása és előállítása Bazaral és Helinski módszerével [J. Mól. Bioi., 36, 185 (1968)] 1 [tg pDI 10 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk az E. coli K12 294/pDI 10, NRLL B-15097 törzsből. A dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban oldjuk, ennek összetétele a következő: 1 mM etilén-diamin-tetraecctsav, 10 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8. 20 p.g/ml koncentrációjú oldatot készítünk. Mivel az E. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
