202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
3 HU 202 585 B 4 mazó pDIlO plazmid "2,7 kb PstI fragmenst magában foglaló dezoxi-ribonukleinsav-szcgmenst, 2. E. coli replikációs origót és 3. E. coliban funkcionális polipeptidet kifejező gént összekapcsolunk. A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti módszer során használt klónozó vektorok és transzformánsok előállítására; ezek fontosak a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav által meghatározott termékeket bioszintetizáló mikroorganizmusokkal végzett nagy méretű fermentációs biztonságosság tételére. Restrikciós és modifikációs rendszer nélkül sok tenyészet bakteriofággal fertőzhető, így csökken az adott termék bioszintézise. A találmány szerinti eljárást a Haemophylus haemolyticus Hhall restrikciós-modifikációs rendszerével szemléltetjük. A Hhall restrikciós-modifikációs rendszert meghatározó gének egymáshoz közel helyezkednek el, és a Hhall restrikciós endonukleáz és egy ezzel összefüggő metiláz enzim bioszintézisét kódolják. A Hhall restrikciós enzim a GANTC CTNAG’ szekvenciát ismeri fel, és hasítja a kétszálú dezoxi-ribonukleinsavon; ugyanakkor a vele összefüggő modifikációs metiláz metilezi a megadott szekvencia nukleotidjait. A témában jártas szakemberek tudják, hogy a metiláz enzim által meghatározott modifikációs rendszemek azelőtt kell kifejeződnie, mielőtt a Hhall restrikciós enzim bioszintézise bekövetkezik. A Hhall restrikciósmodifikációs rendszert tartalmazó sejtek így védve vannak a Hhall emésztéssel szemben, ugyanakkor a Hhall helyet tartalmazó, nem módosított, idegen, kétszálú dezoxi-ribonukleinsavak hasadnak. így a Hhall restrikciós-modifikációs rendszer alkalmas a találmány szerinti eljárás szemléltetésére. Részletesebben szólva, a találmány szerinti eljárást úgy szemléltetjük, hogy a pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI restrikciós fragmensét a pIA7A4Al plazmid inzulin A láncába klónozzuk. A pIA7A4Al tartalmazza az E. coli triptofán promoterét, tartalmaz antibiotikum rezisztenciát meghatározó markereket, tartalmaz továbbá egy olyan gént, amely az E. coli KI2 tip E protein egy részét a humán inzulin A polipeptid láncával fuzionálva tartalmazó fuzionált génterméket fejez ki. A pIA7A4Al plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán adjuk meg. A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI fragmense Hhall specificitású restrikciós és modifikációs géneket tartalmaz. A pDI 10 plazmidot az E. coli KI2 294/pDI10 sejtekből izoláljuk. A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményben van letétbe helyezve: Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois. A pDIlO plazmid forrásaként a B-15097 számon rendelhető meg. A konvenciók szerint a „A” jel deléciót jelent. így például egy plazmid jellemzése során a „AEcoRI-Xbal” jellel olyan plazmidot adunk meg, amelyből az EcoRI és Xbal restrikciós helyek közötti nukleotid-szekvencia ezen enzimekkel való emésztéssel kihasadt. Az egyszerűség kedvéért bizonyos deléciókat számmal jelzünk, így például a pBR322 plazmidban a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént megelőző EcoRI felismerhető hely első bázispárjától kezdődően a „Al” azt jelenti, hogy az 1-30. bázispár (azaz AEcoRI-HindlII) kiesett, így nincs jelen a tetraciklin promoter/operátor rendszer. A „A2” azt jelenti, hogy az 1-375 bázispár (azaz AEcoRI-BamHI) és ennek következtében a promoter/operátor rendszer és a struktuigén (tetraciklin rezisztencia) egy része kihasadt. A „A4” a trp operon fragmens 900-1500. bázispáijának kiesését jelzi, azaz eliminálódott a trp D polipeptid struktuigénje. A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI Hhall restrikciós-modifikációs génjét tartalmazó restrikciós fragmens pIA7A4Al plazmidba való klónozásakor a pPR26 éspPR27 új plazmidokat kapjuk. Mindkét plazmid megvédi a baktériumot, így például a különböző E. coli törzseket a természetben előforduló bakteriofágok fertőzésétől. A pPR26 és pPR27 plazmidok restrikciós térképét a mellékelt 2. ábrán adjuk meg. A találmány szerinti eljárást a pPR28 és pPR1228 új plazmidok előállításával is szemléltethetjük. A pPR28 és pPR1228 plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú, Hhall restrikciós-modifikációs gént tartalmazó PstI restrikciós fragmensét beépítjük a pIB7A4Al plazmidba. A pIB7A4Al plazmid tartalmazza az E. coli triptofán promotert, antibiotikum rezisztencia markereket, és tartalmaz továbbá egy olyan gént, amely E. coli K12 tip E proteinrészt és ezzel fuzionálva a humán inzulin B polipeptid láncát meghatározó, fuzionált génterméket határoz meg. A pPR28 és pPR 1228 plazmidok szintén megvédik a baktériumokat, például a különböző E. coli törzseket a természetben előforduló bakteriofágoktól. A pIB7A4Al plazmid és a pPR28 és pPR1228 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 3. és 4. ábrákon adjuk meg. A pPR27 plazmid 6,2 kb nagyságú, Hhall restrikciós-modifikációs gént tartalmazó Aval-BglII restrikciós fragmensének és a pHI7AlA4 plazmid 2,3 kb nagyságú Aval-BglII restrikciós fragmensének ligálásakor egy új plazmidot, a pPR29 jellel jelzett plazmidot kapjuk. A pHI7A4Al plazmid tartalmazza az E. coli triptofán promotert, tartalmaz antibiotikum rezisztencia markereket és egy olyan gént, amely az E. coli K12 trp E protein egy részét és a humán proinzulin polipeptidet fuzionálva tartalmazó fuzionált génterméket fejez ki. A pPR29 plazmid restrikciós és modifikációs aktivitással rendelkezik, és így megvédi a baktériumokat, például a különböző E. coli törzseket a természetben előforduló bakteriofág-fertőV.ésektől. A pHI7A4Al és pPR29 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét az 5„ illetve 6. ábrákon adjuk meg. A találmány szerinti eljárás rugalmasan használható, és felhasználható bármely olyan esetben, amikor rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor által meghatározott bioszintézis történik, de felhasználható bármely endogén metabolikus bioszintézis esetén is. Előnyösen rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorként plazmidot használunk, de felhasználhatunk bakteriofágot, kozmidot és más vektorokat is. A találmány szerinti eljárás során felhasználhatunk bármely restrikciós és modifikációs rendszert, azzal a feltétellel, hogy a gének koordinálván fejeződnek ki, azaz, a modifikációs funkció a restrikciós funkció előtt fejeződik ki. Mivel a találmány szerinti eljárás felhasználhatósága független a klónozó vektorban levő markerektől vagy más génektől, az eljárás előnyösen alkalmazható rekombináns vagy más, olyan törzsek esetén is, amelyek egy vagy több gyakorlati vagy kutatási értékkel rendelkező gént hordoznak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
