202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
21 HU 202 585 B 22 gen. A csíkokat 0,5 pg/ml etidium-bromid-oldat adagolásával tesszük láthatóvá, és ultraibolya fényben vizsgáljuk. A szükséges fragmensl kihasítjuk, és 1 órán át 150 V feszültségen TBE-oldatba elektro-eluáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat DEAE-cellulózon (Whatman DE52) kötjük, az oszlopot egyensúlyi pufferral egyensúlyozzuk ki. Ennek összetétele: 0,1 M kálium-klorid és 10 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8. Az oszlopot az egyensúlyi pufferral mossuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű eluciós pufferral eluáljuk: 1 M nátrium-klorid és 10 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8. Az eluátum nátrium-ion koncentrációját víz adagolásával 0,35 M-ra állítjuk be, ezután pedig két térfogat 100%-os etanol adagolásával és egy éjszakán át -20 "C hőmérsékleten való hűtéssel kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. A kapott csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, szárítjuk és TE-oldatban oldjuk. 6. példa A plA7A4A7 plazmid Pstlfragmensének izolálása A 2. példában megadottak szerint előállított pIA7A4Al plazmid 0,5 pg-jál 3 órán ál 37 'C hőmérsékleten Pstl restrikciós enzimmel kezeljük, az 5. példában megadottak szerint. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat egyszer fenollal és kétszer kloroform és izoamil-alkohol 24 : 1 arányú elegyével extraháljuk, ismert módon. Az oldatot 0,1 térfogat, 3 M nátrium-acetát-oldattal (pH = 8) keverjük, és kicsapjuk oly módon, hogy 2,2 térfogai etanolt adunk hozzá, és egy éjszakán át -20 °C hőmérsékléeten tartjuk. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, szárítjuk és TE-oldatban oldjuk. 7. példa A plB7A4Al plazmid Pstl enzimmel emésztett fragmenseinek izolálása 0,5 Mg, a 3. példában megadottak szerint előállított pIB7A4A 1 plazmidot 3 órán át 37 *C hőmérsékleten Pstl restrikciós enzimmel kezelünk, az 5. példában megadottak szerint eljárva. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat fenollal, és ezután kétszer kloroform és izoamil-alkohol 24 : 1 arányú elegyével extraháljuk, ismert módon. Az oldatot 0,1, 8,0 pH-jú, 3 M nátrium-acetát-oldattal keverjük, és 2,2 térfogat 100%-os etanol adagolásával kicsapjuk. Egy éjszakán át -20 "C hőmérsékélcten hűtjük a szuszpenziót. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, szárítjuk és TE-oldatban oldjuk. 6. példa A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú Pstl fragmensének kapcsolása a pl A 7A4A1 plazmid Pstl fragmenséhez 0,2 Mg Pstl enzimmel emésztett pl A7A4 A l plazmidot és 1,1 Mg. a pDIlO plazmid Pstl enzimmel kapott 2,7 kb nagyságú fragmenst 400 pl alábbi összetételű TE/10 oldatban keverünk: 1 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = =7,8,0,1 mM dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsav. 0,1 térfogat 8,0 pH-jú, 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adagolunk, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 2,2 térfogat 100%-os etanol adagolásával kicsapjuk, és a szuszpenziót -20 ’C hőmérsékleten tartjuk egy éjszakán át. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és szárítjuk. A ligációs reakciót 3,3 pl reakcióelegyben végezzük, ez az alábbi összetételű: 2 pl dezoxi-ribonukleinsav (vizes oldatban), 0,6 pl, 5 x kináz-ligáz-puffer (50 mM magnézium-klorid, 25 mM ditio-treilol, 250 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8, 25% glicerin), 0,6 pl, 0,66 mmólosadenozin-trifoszfát-oldatésO,l pl, 1 egység/pl töménységű T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-oldat. A reakcióclegyet egy éjszakán át inkubáljuk, 15 ”C hőmérsékleten. 9. példa A pDIlO plazmid 2,7 kb nagyságú Pstl fragmensének ligálása a pIB 7A4 AI Pstl enzimmel hasított plazmidhoz A ligációt a 8. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pIA7A4Al plazmid helyett a Pstl enzimmel hasított pIB7A4Al plazmidot használjuk. A reakcióelegyet egy éjszakán át inkubáljuk, 15 ‘C hőmérsékleten. 10. példa Az E. coli K12 RV308/pPR26 és az E. coli K12 RV308fpPR27 előállítása és apPR26 éspPR27plazmidok izolálása A 8. példában megadottak szerint előállított ligáit dezoxi-ribonukleinsav 0,1 pg-jál 50 pl SSC/10 oldatban hígítjuk. A dczoxi-ribonukleinsavval kompetens E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk, az 1. példában megadott transzformációs eljárást használva. Az E. coli K12 RV308/pPR26 és E. coli K12 RV308/pPR27 transzformánsokat 5 pg/ml tctraciklint tartalmazó L-agaron tenyésztve izoláljuk. Az izolátumok tetraciklin rezisztenciáját és ampicillin érzékenységét vizsgáljuk. A megfelelő telepeket használjuk fel a kovalensen zárt, kör alakú plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálására, amit Bazaral és Helinski (1968) módszerével végzünk. A plazmidok szerkezetét restrikciós endonukleázos analízissel bizonyítjuk. Két orientációjú plazmidot kapunk, mivel a 2,7 kb nagyságú Pstl restrikciós fragmens két irányban épülhet be. A pPR26 és pPR27 plazmidokal és a megfelelő transzformánsokat megkapjuk a fenti eljárással. 11. példa Az E. coli K12 RV308/PPR28 és az E. coli K12 RV308/pPR1228 előállítása és a pPR28, illetve a pPR1228 plazmidok izolálása All. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 8. példában megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav helyett a 9. példában megadottak szerint előállított terméket használjuk. Az E. coli K12 RV308/pPR28 és az E. coli K12 RV308/pPR1228 transzformánsokat izoláljuk és a bennük levő plazmidok szerkezetét restrikciós endonukleázzal kivitelezett térképezéssel bizonyítjuk. Két orientációjú plazmidot kapunk, mivel a plazmidban levő 2,7 kb nagyságú Pstl restrikciós fragmens mindkét irányban beépülhet. így a fenti eljárás során megkapjuk mind a pPR28, mind pedig a pPR1228 plazmidokat és ezek transzformánsaiL 12. példa Az E. coli K12 RV308/pPR29 előállítása és a pPR29 plazmid izolálása A) A pPR27 plazmid 672 kb nagyságú Aval - Bglll fragmensének izolálása A pPR27 plazmid a 331 sorszámú bázispámál egyetlen Bglll restrikciós helyet és a 2334 sorszámú bázispárnál egyetlen Aval helyet tartalmaz. A 10. példában megadottak szerint előállított pPR27 plazmid 8 pg-ját az alábbi összetételű reakcióelegyben 16 egység Aval rcst-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
