202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
23 HU 201 183 B 24 rikciós enzimmel (BRL, 2 egység/pl) teljesen emésztünk: 20 mM trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 30 mM nátrium-klorid. A reakciót 37 ‘C hőmérsékleten végezzük. 20 pl, 10X BglII puffer adagolását követően a reakcióelegyet 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk, 60 percen át, majd 5 percen át 65 *C hőmérsékleten. A puffer összetétele a következő: 1M trisz-hidrogén-klorid, pH= = 8,0, 50 mM magnézium-klorid és 600 mM nátriumklorid. A reakcióelegy tartalmaz továbbá 25 pl vizet és 5 pl Bgin restrikciós enzimet (New England Biolabs, 1,6 egység/pl). A hasított dezoxi-ribonukleinsavat agaróz gél-elektroforézissel frakcionáljuk, és a 6,2 kb nagyságú fragmenst TE-oldatba elektro-eluáljuk, majd DEAE cellulóz oszlopon kromatografáljuk, az 5. példában megadottak szerint eljárva. B) A pIII7A4A7 2J kb nagyásúg Aval - BglII fragmensének izolálása A pHI7A4Al plazmid egyetlen BglII restrikciós helyet tartalmaz a 331. sorszámú bázispár mentén, és egyetlen Aval helyet a 2614. sorszámú bázispámál. A 4. példában megadottak szerint előállított pHI7A4Al plazmid 15 pg-ját Aval és BglII restrikciós enzimekkel teljesen emésztjük, a 12A) példában megadottak szerint eljárva. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat agaróz gélelektroforézissel frakcionáljuk, és a 6,2 kb nagyságú fragmenst TE-oldatba elektro-eluáljuk, majd ezután az 5. példában megadottak szerint eljárva DEAE cellulóz oszlopon kromatografálva tisztítjuk. C) A pPR27 plazmid 62 kb nagyságú Aval - BglII fragmensének kapcsolása a pH 17A4 A1 plazmid 22 kb nagyságú Aval - BglII fragmenséhez A 12A) példában megadottak szerint előállított pPR27 plazmid 6,2 kb nagyságú Aval - BglII fragmensének 2,3 pg-ját és a 12B) példában megadottak szerint előállított pHI7A4Al plazmid 2,3 kb nagyságú Aval - BglII fragmensének 0,85 pg-ját 570 pl TE-oldatban keverjük. A dezoxi-ribonukleinsavat a 8. példában megadottak szerint kicsapjuk. Az izolált dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetétel, 10,1 pl reakcióelegyben ligáljuk: 2 pl 5X kináz-ligáz-puffer, 2 pl, 0,66 mM adenozin-trifoszfát-oldat, 6 pl víz és 0,1 pl, 1 egység/pl koncentrációjú T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz. Az elegyet egy éjszakán át 9 'C hőmérsékleten inkubáljuk, majd ismert módon izoláljuk az előállítani kívánt dezoxi-ribonukleinsavat. D) Az E. coli K12 RV308lpPR29 előállítása és a pPR29 plazmid izolálása A 10. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a 8. példában megadott termék helyett a 12Q példa szerint előállított, ligáit dezoxi-ribonukleinsavat használjuk. Az E. coli K12 RV308/pPR29 törzset izoláljuk, és a benne levő plazmid szerkezetét restrikciós endonukleázok által felismerhető helyek térképezésével bizonyítjuk. Az előzőekben megadott eljárással a következő, III. táblázatban megadott reprezentatív transzformánsokat állíthatjuk elő. III. táblázat Jellemző transzformánsok 1. E. coli K12 294/pPR26 2. E. coli K12 294/pPR27 3. E. coli K12 294/pPR28 4. E. coli K12 294/pPR1228 5. E. coli K12 294/pPR29 6. E. coli K12/pPR27 7. E. coli K12 C600/pPR26 8. E. coli K12 C600/pPR27 9. E. coli K12 C600/pPR28 10. E. coli K12 C600/pPR1228 11. E. coli K12 C600/pPR29 12. E. coli/pPR27 13. E. coli K12 C6ÖORk Mk-/pPR26 14. E. coli K12 C600RkMk-/pPR27 15. E. coli K12 C600Rk'MkVpPR28 16. E. coli K12 C600Rk Mk7pPR 1228 17. E. coli K12 C600Rk Mk7pPR29 18. E. coli K12/pPR28 19. E. coli K12 HB101/pPR26 20. E. coli K12 HB101/pPR27 21. E. coli K12 HB101/pPR28 22. E. coli K12 HB101/pPR1228 23. E. coli K12 HB101/pPR29 24. E. coli/pPR28 25. E. coli K12 BE827/pPR26 26. E. coli K12 BE827/pPR27 27. E. coli K12 BE827/pPR28 28. E. coli K12 BE827/pPR1228 29. E. coli K12 BE827/pPR29 30. E. coli K12/pPR29 31. E. coli/pPR29. SZABADALMI IGÉNYPONOK 1. Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló 2 szálú, DNS-t és ezen Hhall restrikciós endonukleáz helyet tartalmazó bakteriofág ellen, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdasejtet 1. a baktérium szempontjából Hhall restrikciós és metilező modifikációs aktivitást meghatározó gént tartalmazó pDHO plazmid ~2,7 kb PstI fragmenst magában foglaló dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, 2. E. coli replikációs origót és 3. az E. coliban funkcionális polipeptidet meghatározó gént tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorral transzformálunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorként egy plazmidot alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli gazdasejtként E. coli K12 törzset alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektort alkalmazunk, mely humán pre-proinzulint, humán proinzulint, humán inzulin A-láncot vagy humán inzulin B-láncot meghatározó gént tartalmaz. 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pPR26, pPR27, pPR28, pPR29 vagy pPR1228 plazmidot alkalmazunk. 6. Eljárás E. coli baktérium védelmére felhasználható rekombináns klónozó vektor előállítására természetben előforduló, Hhall restrikciós helyet tartalmazó kétszálú dezoxi-ribonukleinsavval rendelkező bakteriofág ellen, azzal jellemezve, hogy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
