202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
19 HU 202 585 B 20 az 500 bázispámál nagyobb fragmenseket eluáljuk. A fragmensek 3’-végeihez oligo-dezoxi-citidilsavval kapcsolunk, terminális dezoxi-nukleotidii-transzfcrázzal Maizei szerint eljárva [Meth, Virol., 5,180 (1971)]. A dC-végű cDNS fragmenseket olyan pBR322 plazmidhoz kapcsoljuk, amelyet először PstI restrikciós enzimmel emésztettünk, és azután terminális dezoxi-nukleotidil-transzferázzal dezoxi-guanidilsav véggel láttunk el. A kapott plazmidokat E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. A tetraciklinre rezisztens, de ampicillinrc érzékeny telepeket izoláljuk, és három PstI restrikciós helyet tartalmazó plazmidokra szkrinelünk. Ez a restrikciós kép azt jelzi, hogy a proinzulin gén jelen van [Sures és munkatársai, Science, 208, 57 (1980)]. A pHI 104 jellel jelzett egyik plazmid 600 bázispárból álló beépített szakaszt tartalmaz, és adja a PstI restrikciós képet, továbbá a 3’-poli A és a poliGC, a cDNS előállítása során beépített részek között egy BamHI helyet tartalmaz. A 10. ábrán megadjuk a beépített szakasz nukleotid-szekvenciáját. Ez a szekvencia kicsit különbözik a Sures és munkatársai (1980) és Bell és munkatársai [Nature, 282, 525 (1979)] állal közölttől (egy adenin-timint - aláhúztuk - GC pár helyettesít), mivel a felhasznált mRNS különböző szövetből volt izolálva. D) Humán proinzulint meghatározó gén összeállítása A humán proinzulint meghatározó gén előállítását a mellékelt 11. ábrán adjuk meg. A proinzulin első 31 aminosavát meghatározó szintetikus gén-szegmenst, a 11. ábra 1. fragmensét 50 pg pIB3 plazmidból nyerjük EcoRI és Hball restrikciós endonukleázokkal, ahogy azt az előzőekben megadtuk. Ez a fragmens a preproinzulin előszekvenciája helyett a metionin ATG kodonját is tartalmazza. A 32-86. aminosavakat meghatározó cDNS génszegmenst, továbbá a transzlációs stop kodonokat és az mRNS 3’-nem transzlatált szakaszát 40 pg pHI104 plazmidból izoláljuk oly módon, hogy először BamHI és ezután Hpall restrikciós enzimmel kezeljük. A két fragmenst poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektro-elucióval izoláljuk. T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal összekapcsoljuk a gén-fragmenseket, a reakciót 20 pl ligáz-pufferban végezzük [Goeddel és munkatársai (1979)], 4 'C hőmérsékleten, 24 órán át. A reakcióelegyet 50 pl vízzel hígítjuk, fenollal és kloroformmal extraháljuk mindegyiket, majd etanollal kicsapjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel kezeljük, ezen helyek regenerálására és a gén-polimerek eltávolítására. Az összeállt proinzulin gént poliakril-amid gél-elektroforézissel izoláljuk és T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal összekapcsoljuk az EcoRI és BamHI enzimekkel hasított pBR322 plazmiddal. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk, és a kapott telepeket tetraciklin-érzékenység és ampicillin rezisztencia alapján szelektáljuk. Az egyik ilyen telepből izolált pHI3 plazmid tartalmazza az adott proinzulin gént, ezt ezután nukleotid-szekvencia-analízisscl jellemezzük. E) Humán proinzulint tartalmazó kimer prot ein kifejezésére képes plazmid előállítása A pHI3 plazmidból EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel kihasítjuk a metionint meghatározó N-tcrminális kodonokat is tartalmazó teljes humán proinzulin gént. Az adott fragmenst gél-elektroforézissel tisztítjuk, és ezután T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal hozzákapcsoljuk a pSOM7A4Al plazmid részleges PstI - EcoRI emésztéssel kapott fragmenséhez és a 2F) példában megadottak szerint előállított pHKYlO plazmid nagyobb PstI - Bgin fragmenséhez. A pSOM7A4A 1 fragmenst úgy állítjuk elő, hogy részleges EcoRI emésztést, majd ezután teljes PstI emésztést végzünk. A kapott fragmens tartalmazza a trp promoter/operátor rendszert, izolálását poliakril-amid gél-elektroforézist követő elektro-elucióval végezzük. A részleges EcoRI emésztésre azért van szükség, hogy olyan fragmenshez jussunk, amely a szomatosztatin gén 5’-végével szomszédos részen hasad, nem válik szét azonban az ampicillin-rezisztencia gén és a trp promoter/operátor rendszer közölt fekvő EcoRI helyen. Az ampicillin rezisztencia génben bekövetkező PstI hasadás miatt elveszik az ampicillin rezisztencia, ez azonban visszaállítható oly módon, hogy ligációt végzünk a 2F) példában megadottak szerint előállított végső pHKYlO lineáris dezoxi-ribonukleinsavval. EcoRI és BamHI végekkel rendelkező, 1 [tg teljes humán proinzulin gént, 4 pg PstI - EcoRI (részleges) pSOM7A4Al fragmenst és 1 pg pHKYlO PstI - BglII fragmenst összekapcsolunk 4 ’C hőmérsékleten, 24 órán át tartó reakcióval, ligációs pufferban, T4 dezoxi-ribonuklcinsav-ligáz jelenlétében. A ligációs dezoxi-ribonukleinsav eleggyel E. coli K12 294 sejteket transzformálunk Goeddel és munkatársai (1979) szerint eljárva. Az ampicillin és tclraciklin jelenlétében egyaránt növekvő telepeket szelektáljuk, ezek a nátrium-dodecil-szulfátos poliakril-amid gélelektroforézis [Maizei, 1971] szerint tartalmazzák a pHI7A4Al plazmidot, és kifejeznek egy olyan proteint, amely megfelel a trp LE’-proinzulin fúziós termék molekulasúlyának. A fenti proteint kifejező pHI7A4Al plazmidot dezoxi-ribonukleinsav-szekvenálással és a beépített gén, továbbá a vektor restrikciós térképezésével teljesen jellemezzük. A pHI7A4Al plazmidot a mellékelt 5. ábrán mutatjuk be, a plazmid az ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gének jelenléte révén könnyen szelektálható. 5. példa A pDllO plazmid 2,6 kb nagyságú PstI fragmensének izolálása A pDllO plazmid 2,7 kb nagyságú PstI fragmense Hhall specificitású restrikciós és modifikációs géneket tartalmaz. E. coli K12 294/pDI10 sejtekből 15 pg kovalensen zárt, kör alakú pDllO dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, majd teljesen emésztjük PstI restrikciós enzimmel, 37 °C hőmérsékleten kivitelezett reakcióban. A reakcióelegy 35 pl, az 1. példában megadottak szerint előállított pDI 10 oldatot, 15 pl 10 x PstI puffert (100 mM magnézium-klorid, 500 mM ammónium-szulfát és 200 mM trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5), 15 pl, 1 mg/ml töménységű borjú szérum albumint, 77,5 pl vizet és 17,5 pl PstI restrikciós enzimet (1 New England Biolabs egység/pl) tartalmaz. Ahasított dezoxi-ribonukleinsavat agaróz gél-eletkroforézissel frakcionáljuk olyan gélen, amely 0,8 agarózt tartalmaz az alábbi összetételű TBE-oldatban: 10,8 g trisz-bázis, 5,5 g bórsav és 0,09 g dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsav 1 1 vízben. Az elektroforézist 1,5 órán át végezzük 220 V feszültsé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
