202585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli baktérium védelmére természetben előforduló bakteriofág ellen
1 HU 202 585 B 2 A találmány tárgya új eljárás E. coli baktérium védelmére, természetben előforduló bakteriofágok ellen, és eljárás a módszerben használt klónozó vektorok és transzformánsok előállítására. A találmány szerinti eljárás különösen fontos, mivel ezzel megoldhatjuk a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó baktériumtenyészetek tömeges fágfertőzésének problémáját. Ez előnyös, mivel, ha egy adott terméket meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat egyszer transzformálunk egy gazdasejtbe, úgy alapvető fontosságú az, hogy a gazdasejtet megvédjük bakteriofágok ellen. A védelem alapvető fontosságú, mivel a transzformáns tenyészetek nagyon gyakran érzékenyek bakteriofágokra, amelyek fertőzés esetén az egész tenyészetet lizálják. Mivel a termék genetikai kifejeződése attól függ, hogy a gazdasejtek az adott bioszintézis lejátszódására elég hosszú ideig életben maradnak-e, a fertőzött tenyészet termelőkapacitása csökken. A mikroorganizmusok fágfertőzése ismert jelenség. A vírus, vagy a bakteriális fertőzés esetén a bakteriofág kapcsolatba kerül a sejttel, adszorbcálódik, és reagál a gazdasejt sejtmembránjával. Az adszorpciókor a fág kromoszómája vagy genetikai anyaga belép a gazdasejtbe, és elkezdődik az a folyamat, amelynek során a sejt bioszintetikus eseményei szünetelnek, és elsősorban az új fágok termelésére állnak rá. A gazdasejt érett fágokkal telítődik, és ezután lizál; általában az eredeti fertőzést követő 30 percen belül. Az új fágok fertőzőképesek, és a ciklus addig ismétlődik, míg az összes jelenlévő gazdasejt elpusztul. Eddig a nagyméretű fermentorokban E. coli sejtekkel végzett rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiák fejlődését hátráltatta a fentiekben ismertetett fágfertőzéssel együttjáró probléma. Tény, hogy a többféle bakteriofág jelenlétében bekövetkező fertőzés jelentősen hozzájárul ahhoz, hogy egy adott termék bioszintézise létrejön-e vagy sem. Ez a nehézség különösen akkor játszik szerepet, ha a fermentációt nagy térfogatban végezzük, amikor elveszhet az E. coli transzformánsokból álló tenyészet A találmány szerinti eljárással a bakteriofágok jelenlétével együttjáró problémákat megszüntethetjük, olcsón kivitelezhető és hatásos módszert alkalmazva a transzformánsok védelmére a természetben előforduló bakteriofágok ellen. Úgy járunk el, hogy a gazdasejteket egy olyan restrikciós rendszerrel látjuk el, amely képes emészteni a Hhall helyet tartalmazó idegen dezoxi-ribonukleinsavat. A Hhall hely a legtöbb természetben előforduló vírusban jelen van, így a találmány szerinti eljárást hatásosan használhatjuk a nehézségeket okozó bakteriofágok nagy része ellen. Amikor a fág dezoxi-ribonukleinsava a találmány szerinti gazdasejtbe bejut, a Hhall restrikciós endonukleáz a Hhall helyen emészti a dezoxi-ribonukleinsavat, amiután a fág életképtelen és veszélytelen lesz. Ily módon a baktérium gazdasejtek védhetők a természetben előforduló fágok tói, így biztosítjuk a tenyészet termelőképességét. Ez nem csupán előnyös, de jelentős előrehaladást jelent a jelenleg használt módszerekben. Ha egyáltalán léteznek, igen kevés más módszert használnak az E. coli és más baktériumok részvételével végzett nagyméretű fermentációk bakteriofágok jelenlétével összefüggő problémáinak megoldására. Tény, hogy a bakteriofág fertőzések bekövetkeznek a leggondosabb steril feltételek biztosítása közben is, és ha egyszer megjelenik, a bakteriofágot igen nehéz eliminálnunk. Bár a bakteriofág eltávolítása lehetséges, igen kényelmetlen és költséges időveszteséggel vagy termeléskieséssel jár. A jelen leírás során az alábbi kifejezéseket használjuk: Funkcionális polipeptid: kinyerhető, biológiailag aktív külső eredetű polipeptid vagy prekurzor, egy külső eredetű polipeptidből és részben vagy teljesen homológ polipeptidből álló kinyerhető, biológiailag aktív polipeptid, külső eredetű polipeptidet és egy biológiailag inaktív, homológ polipeptidet tartalmazó, kinyerhető, biológiailag inaktív, fúziós termék, amely specifikusan hasítható, végül enzimfunkcióval rendelkező polipeptid. Fuzionált géntermék: olyan külső eredetű, kinyerhető polipeptid, amely homológ (a sejthez tartozó) polipeptid egy részével vagy teljes egészével fuzionált. Marker: a kromoszómán vagy egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektoron ismert helyen elhelyezkedő és ismert funkciójú gén vagy gének kombinációja. Transzformáns: transzformációval előállított recipicnsgazdasejt. Érzékeny baktérium: fág jelenlétében növesztve fertőzhető baktérium. Restrikciós fragmens: olyan, plazmidból, más vektorból vagy kromoszomális dezoxi-ribonukleinsavból előállított lineáris szakasz vagy lineáris teljes molekula, amelyet egy vagy több restrikciós enzimmel kapunk. Beépülési izomer: két vagy több lehetséges rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekula közül az egyik, amely akkor jön létre, amikor egy dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst beépítünk két vagy több, befogadó dezoxi-ribonukleinsav-molekulán levő hely egyikébe. R-M-rendszer: restrikciós és modifikációs rendszer. AmpR: ampicillin rezisztens fenotípus. Amps: ampicillin érzékeny fenotípus. TetR: tetraciklin rezisztens fenotípus. Tets: tetraciklin érzékeny fenotípus. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy E. coli gazdasejtet 1. a baktérium szempontjából Hhall restrikciós és metilező modifikációs aktivitást meghatározó gént tartalmazó pDIlO plazmid ~2,7 kb PstI fragmenst magában foglaló fezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, 2. E. coli replikációs origót és 3. az E. coliban funkcionális polipeptidet meghatározó gént tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorral transzformálunk, azzal a feltétellel, hogy 1. a természetben előforduló bakteriofág Hhall restrikciós helyet tartalmaz egy kétszálú dezoxi-ribonuklcinsavon, és 2. a metilező modifikációs aktivitás előtt nyilvánul meg. A kétszálú dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó, természetben előforduló bakteriofág ellen felhasználható, specifikus restrikciós helyet tartalmazó rekombináns klónozó vektorok előállítására a találmány értelmében úgy járunk el, hogy 1. koordinativen és egymás után következően Hhall restrikciós aktivitást és metilező kifejező géneket tartal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
