202584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GM-CSF-fehérje-származékok és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
11 12 HU Szintézisblokk II (CSF II) Enzim Felismerőszekvencia Hasítási hely előtti nukleotid sorszáma (kódolószál) AflIII AiCATGT 157 Miül AiCGCGT 169 Xhol cXtcgac 175 Taq I TlCGA 176 Hgal GACGC (5/10) 177 Aval CXTCGAG 177 Alul AGiCT 180 Sac 1/ HgiAI GAGCTiC 182 Stul/ Hael AGGiCCT 194 Szintézisblokk III (CSF III) Enzim Felismerőszekvencia Hasítási hely előtti nukleotid sorszáma (kódolószál) AflII CÍTTAAG 217 HaelII GGiCC 224 Apai GGGCCÍC 227 Mnl I CCTC (7/7) 238 Nhe I GiCTAGC 241 Maci CiTAG 242 Ahall GAiCGTC 280 AatlI GACGTlC 283 Sei NI GXCGC 287 Mst I TCGXGCA 288 Sau 3AI/ Mbo I XGATC 296 Dpn I GAÍTC 298 AsuII ttícgaa 308 Aha III tttXaaa 318 Avail gígtcc 382 EcoRII iCCAGG 384 BstNI/ Ser FI CCiAGG 380 A három szintézisblokkot először egyenként klónoztuk, E. colihoz alkalmaztuk és ismét izoláltuk: A (69) CSF I szintézisblokkot (16) pUC 12 származékba építjük be, amelynek során pS 200 plazmidot (72) kapunk. A pUC 12 származékot Pst I és Hind III restrikciós enzimekkel nyitjuk és a (70) CSF II szintézisblokk kiegyenesített (73) plazmidjával ligáljuk, amelynek során pS 201 plazmidot (74) kapunk. A pUC 13 származékot Hind III és Sma I segítségével nyitjuk és a kiegyenesített (75) plazmidot (71) CSF in-mal ligáljuk, amelynek során pS 202 plazmidot (76) kapunk. Az ismét izolált (69), (70) és (71) szintézisblokkokat ezután EcoRI és Sma I segítségével kiegyenesített (77) pUC 12 vektorba ligáljuk, amelynek során pS 203 plazmidot (78) kapunk. Ezt a hibrid plazmidot, mint az egyes szintézisblokkokat tartalmazó plazmidokat, E. * 584 B • coli 79/02-vel (ATCC 39403) alkalmazzuk és a szintetizált gént restrikciós és szekvencia analízissel jellemezzük. A (78) plazmidot Pvu I segítségével részlegesen és Bam Hl segítségével hasítjuk, majd a teljes CSF szekvenciát tartalmazó kis (79) fragmenst izoláljuk. A (21) kifejező plazmidot EcoRI és Bam Hl segítségével nyitjuk, és a nagy (80) fragmenst izoláljuk. A (80) fragmenst az IL-2 rész-szekvenciát tartalmazó (26) fragmenssel és a szintetikus (79) génnel ligáljuk. Ennek során pS 204 plazmidot (81) kapunk, amely kódolja a fúziós proteint, amelyben az IL-2 rész-szekvenciát először egy olyan híd követi, amely lehetővé teszi a savas hasítást, majd ezután következik a CSF aminosav szekvenciája Savas hasítással tehát olyan CSF származékot kapunk, amely N-terminális végén prol innal van kiegészítve. 11. példa CSF (1-12) His (14-121) His (123-127) Az I szintézisblokkban az la és Ib, valamint Ic és Id oligonukleotidokat (82) és (83) szintetikus szekvenciával kiegészítve olyan módosított I szintézisblokkot kapunk, amely CSF I analógokat kódol, amelyekben az első aminosav (Alá) helyett Trp áll és a 13 pozícióban lévő Trp helyett His áll. A (72) plazmidot (10. ábra) EcoRI és Hupa I segítségével nyitjuk és a nagy (84) fragmenst izoláljuk. Ezt a szintetikus (82) és (83) fragmensekkel ligáljuk, amelynek során pS 205 plazmid (85) keletkezik, amely kódolja a módosított CSF I (CSF I’) szekvenciát. A (76) plazmidot (10. ábra) Hind III és Sal I segítségével nyitjuk és izoláljuk a kis (86) és nagy (87) fragmenseket. A kis (86) fragmenst Taq I segítségével hasítjuk és a (88) fragmenst izoláljuk. A nagy (87) fragmenst a (88) fragmenssel és a 122 pozícióban a Trp kódja helyett His kódot tartalmazó szintetikus (89) fragmenssel ligáljuk, amelynek során pS 206 plazmidot (90) kapunk, amely a módosított CSF III (CSF III’) szekvenciát kódolja. Ezt a plazmidot E. colival transzformáljuk, alkalmazzuk, ismét izoláljuk, Hind III-mal és Sál I-gyel hasítjuk és a kis (91) fragmenst, amely a CSF III’ szekvenciát kódolja, izoláljuk. A (85) plazmidot Pvu I segítségével részlegesen, és Pst I segítségével hasítjuk és a kis (92) fragmenst, amely a CSF I’ szekvenciát kódolja, izoláljuk. A (22), (26), (92), (70) és (91) fragmensek ligálásával pS 207 plazmidot (93) kapunk. Ez olyan fúziós proteint kódol, amelyben az IL-2 rész-szekvenciát olyan híd követi, amely közvetlenül a CSF első aminosavja (Alá) előtt Trp-t tartalmaz. Mivel a CSF molekulában a Trp-t a 13 és 122 pozícióban His-szcl helyettesítettük, a fúziós protein N-bróm-szukcinimiddel hasítható. Ennek során olyan CSF származékot kapunk, amelyben mindkét triptofánt hisztidin helyettesíti. 12. példa CSF (1-99) Thr (101-127) A három szintézisblokk felépítésében a lile és Illf oligonukleotidokat szintetikus (94) szekvenciával helyettesítjük és a továbbiakban a 10. példa szerint járunk el. így olyan CSF származékot kapunk, amelyben a 100 pozíciójú Ile-t Thr helyettesíti. 202 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
