202584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GM-CSF-fehérje-származékok és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 202 584 B 14 13. példa CSF (1-35) Ile (37-45) Leu (47-78) Leu-Leu (81-127) Először (95) oligonukleotidot szintetizálunk, amely a 36 pozícióban az Ile kódja helyett Met kódot tartalmaz és olyan (96) oligonukleotidot szintetizálunk, 5 amely a 46 pozícióban a Met kódja helyett Leu kódot tartalmaz. A (72) plazmidot (10. ábra) Pvu I és Xma III segítségével nyitjuk és a (97) fragmenst izoláljuk. Ezután olyan (98) szekvenciát szintetizálunk, amely- 10 ben az első aminosav kódja előtt Met kód található. A (16), (98), (97), (95) és (96) fragmensek ligálásával pS 208 plazmidot (99) kapunk. Ez megfelel a (72) plazmidnak, azonban a CSF I szekvenciában 0 pozícióban Met kódot, 36 pozícióban Ile kódot és 46 pozíció- 15 ban Leu kódot tartalmaz. Ezután (100) szekvenciát szintetizálunk, amelyben a 79 és 80 pozícióban Leu kódja helyeit Met kód található. A (76) plazmidot (10. ábra) Hind III és Nhe I segítse- 20 gével nyitjuk, a nagy (101) fragmenst izoláljuk és szintetikus (100) szekvenciával ligáljuk. így pS 209 plazmidot (102) kapunk, amely a CSF III szekvencia 79 és 80 pozíciójú két kódjának kicserélésével megfelel a (76) plazmidnak. 25 A (93) plazmidot (11a. ábra) Pvu I segítségével részlegesen és Sal I segítségével hasítjuk és a nagy (103) plazmidot izoláljuk. A (99) plazmidot Pvu I segítségével részlegesen és Pst I segítségével nyitjuk és csak kis (104) fragmenst izoláljuk, amely tartalmazza a módosí- 30 tott CSF I szekvenciát Ezenkívül a (102) plazmidot Hind III és Sal I segítségével nyitjuk és a kis (105) fragmenst izoláljuk, amely tartalmazza a módosított CSF III szekvenciát A (103), (104), (70) és (105) fragmenseket ligáivá pS 210 plazmidot (106) kapunk, amely megfelel a (93) plazmidnak (1 la. ábra), azonban olyan CSF származékot kódol, amelyben a 0 pozícióban Met áll és emellett a négy Met maradékot más aminosavak helyettesítik. A (106) plazmiddal E. colit transzformálva indukció után olyan fúziós proteint kapunk, amely halogén-ciánnal hasítható, amelynek során olyan CSF származék keletkezik, amely 36 pozícióban Ile-t és 46, 79 és 80 pozíciókban Leu-t tartalmaz. 14. példa CSF (1-35) Ile (37-45) Leu (47-78) Leu (81-127) A 13. példával analóg módon járunk el, azonban szintetikus (100) szekvencia helyett szintetikus (107) szekvenciát alkalmazunk. így olyan eliminált terméket kapunk, amelyben a 36 pozícióban Ile és a 46 pozícióban Leu áll és ahol a 79 és 80 aminosavak helyeit Leu található. 15. példa CSF (1-35) Ile (37-45) Leu (47-78)-(81-127) A 13. példával analóg módon járunk el, azonban a szintetikus (100) szekvencia helyett szintetikus (108) szekvenciát alkalmazunk. így olyan eliminált terméket kapunk, amelyben a 36 pozícióban Ile és a 46 pozícióban Leu áll és a 79 és 80 pozíciójú aminosavak hiányoznak. Szintézisblokk I (CSF-l) (69) —lei — 1 • • AAT TCG ATC GAC GAC CCG GCG CCG GCC jCGA TCG CCG TCT CCG GC TAG CTG CTG GGC CGC GGC CGG GCT AGC |ggc AGA GGC (Eco Rí) Ile Asp Asp Pro Alá Pro Alá Arg Ser Pro Ser Pro Ic-I y___<1>__________Í2I------------lel Ic *■ le 50 TCG ACC CAG CCC [t GG GAA CAC GTT AAC GCG ATC CAG Ga[a GCG AGC TGG GTC GGG ACC CTT|&TG CAA TTG CGC TAG GTC CTT CGC Ser Thr Gin Pro Trp Glu His Val Asn Ala lie Gin Glu Alá j (10)_______________^ 05) (20)-------------1{ 8
