202584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GM-CSF-fehérje-származékok és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 HU 202 584 B 6 utáni első aminosav egyetlen tripletjét megváltoztatni, amellyel megakadályozzuk a bázispár esetleges kialakulását az mRNS szintjén. Az ilyen változtatások, így egyes aminosavak törlése vagy addíciója, a szakember számára ismert és a találmány oltalmi körébe tartozik. Különösen előnyösek azok a GM-CSF-származékok, amelyek N-terminális végükön prolint tartalmaznak, mivel az ilyen proteinek proteázok támadásával szemben stabilabbak. Különösen előnyös az olyan GM-CSF-származék, amely az N-terminális végen álló prolin mellett tartalmazza a teljes CSF aminosav szekvenciát. Meglepő módon azt találtuk, hogy az első 11 aminosav eliminálásával kapott GM-CSF molekula változatok is biológiailag aktívak. A találmány értelmében előnyösek azok a fúziós proteinek is, amelyek a CSF szekvenciát nemcsak egyszer, hanem előnyösen kétszer vagy háromszor tartalmazzák. Az ilyen fúziós proteinekben a ballaszt rész természetesen csökkentett és így a kívánt protein kitermelése növekszik. Az American Type Culture Collection-ban az ATCC 39 900 szám alatt olyan, E. coliba bevitt pHG 23 plazmid van letétbe helyezve, amelyet a pBR 322 Pst I hasítási helyére beépített CSF-cDNS szekvenciával kaptuk. A DNS szekvencia megfelel a 3 (B) ábrán Wong és munkatársai által ismertetett változatnak. A beépítés során az 5’-vég közelében Pst I hasílóhelyet és a 3’-végen GC-„Tailing” segítségével bevitt PslI helyet alkalmaztunk (0 183 350 sz. európai közrebocsátási irat). A példákban ismertetett eljárások során az egyes eljárási lépéseket Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1982) szerint végeztük. Ezen belül a ligálás vonatkozásában a 286. oldalra, a feltöltés vonatkozásában a 114-116. és 394. oldalra, a transzformálás vonatkozásában a 250-251. oldalra, a DNS gélből történő izolálása vonatkozásában a 164-178. oldalra és minilizátok előállítása vonatkozásában a 368-369. oldalra hivatkozunk. Az alkalmazott plazmidokat a gyártó előírásai szerint használtuk. Amennyiben a példában nincs közelebbi utalás, az alábbi beszerzési forrásokat jelöljük meg: pUC12, pUC13 - Pharmacia Inc., „Molecular Biologicals” katalógus, 1984,58. oldal. 1 1. példa CSF közvetlen kifejezése A kereskedelmi forgalomban kapható pUC12 vektort Sma I és Pst I restrikciós enzimmel felnyitjuk, és a nagy (1) fragmenst izoláljuk. A CSF-t kódoló cDNS szekvenciából Sfa NI-gyel és Pst I-gyel végzett hasítással kinyerjük a (2) fragmenst, ezt a szintetikus (3) linkerrel, majd apUCl 2-1 fragmenssel Egáljuk. Az így kapott pW 201 hibrid plazmid (4) a CSF DNS szekvenciát az ATG startkódhoz kapcsolódva tartalmazza. A (4) hibrid plazmidot Nco I-gyel nyitjuk és az átnyúló véget tompa végű (5) fragmenssel töltjük fel. A pUC12 vektort EcoRI enzimmel nyitjuk, majd a túlnyúló véget feltöltjük. Ezután lúgos marhafoszfatázzal kezeljük, amelynek során pUC12 származékot (6) kapunk. Az (5) és (6) fragmensek ligálásával a CSF-DNS szekvenciát mindkét orientációban tartalmazó vektort kapunk. Ezt pW 203 (7) jellel jelöljük. A (7) vektorból EcoRI és Rsa I segítségével izoláljuk a (8) fragmenst, amely tartalmazza a CSF 63-127 aminosavjainak kódját. Emellett a (4) vektorból Ncol és Rsal segítségével izoláljuk a (9) fragmenst, amely a CSF 1-61 aminosavjainak kódját tartalmazza. A pH 131/5 plazmidot (35 14 113 számú NSZK-beli közrebocsátási irat, 0 198 415 számú európai közrebocsátási irat, 1. példa, 1. ábra) (10) Pvu II-vel nyitjuk, a kis fragmenst eltávolítjuk, és a nagyobb pPH 160 plazmidhoz (11) Egáljuk, ami E. coli sejtekben nagy mennyiségben előfordul. A (11) plazmidot Ncol és EcoRI segítségével nyitjuk és a nagy (12) fragmenst izoláljuk. A (8), (9) és (12) fragmenseket a pW 206 hibrid plazmiddal (13) Egáljuk. így visszaállítjuk a 62 aminosav kódját A kereskedelmi forgalomban kapható pKK65-10 plazmidot (PL Biochemical Inc.) EcoRI segítségével hasítjuk és a (14) fragmenst izoláljuk, amely a két TI és T2 terminátort tartalmazza. Ezt a (14) fragmenst az EcoRI segítségével felnyitott (13) plazmidba ültetjük, amelynek során a pW 225 plazmidot (15) kapunk. E. coli MM 294 (ATCC 33625) baktériumot, amely tartalmazza a (15) plazmidot LB közegben (J. H. Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) 30-50 pg/ml ampicillinnel egy éjszakán keresztül 37 'C-on tenyésztünk. A tenyészetet 2000 pjn/1 kazaminosavat és 1 pg/1 tiamint tartalmazó M9-közeggel (J. M. Miller idézett műve) 1:1000 arányban hígítjuk és 37 "C-on állandó kevertetés közben inkubáljuk. OD^o = 0,5, illetve 1 értéknél 15 p.g/1 koncentráció eléréséig indolil-3-akrilsavat adagolunk, és 2-3 órán, illetve 16 órán keresztül inkubáljuk. Ezután a baktériumokat lecentrifugáljuk, 5 percen keresztül puffcr-elegyben (7 mól/liter karbamid, 0,1 tömeg% SDS, 0,1 mól/1 nátrium-foszfát, pH = 7,0) főzzük és a mintákat SDS-gélelcktroforézis lemezre visszük. A vizsgálatok szerint az olyan sejtek proteinmintája, amelynek trp-operonját indukáljuk, mintegy 14 000- 18 000 Dalton tartományban új proteint tartalmaz, amely a nem indukált sejtekből hiányzik. A megadott indukciós körülmények rázott tenyészetnél érvényesek, nagyobb fermentációnál megfelelően megváltoztatott OD-éprtékeket és adott esetben kis mértékben megváltoztatott induktor-koncentrációkat célszerű alkalmazni. 2. példa Pro°-CSF A pUC12 vektort EcoRI és Pst I segítségével nyitjuk és a nagy (16) fragmenst izoláljuk. A (16) fragmenst (17) DNS szintetikus fragmenssel és (2) fragmenssel (1. példa, 1. ábra) Egáljuk. E. coli JM 103 (ATCC 39403) kompetens sejtjeit a Egáló eleggyel transzformáljuk és a kívánt klőnt szelektáljuk, amely tartalmazza a pW 212 plazmidot (18). A DNS plazmidból Pvu I és Pst I segítségével kihasítjuk a (19) fragmenst, amely tartalmazza a CSF szekvenciát. A pKK 177-3 plazmidba pUC 8 polilinker [Amman és munkatársai: Gene 25 (1983) 167; 0 133 282. számú európai közrebocsátási irat] segítségével beépítjük a lac-represszoít [P. J. Farabaugh: Nature 274, 765-769 (1978)], amelynek során pJF118 plazmidot (1. ábra, 35 26 995.2 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentés) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
