202584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GM-CSF-fehérje-származékok és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 202 338 B 8 (20) kapunk. Ezt az első restrikciós helyen Ava I segítségével nyitjuk és önmagában ismeri módon endonukleáz kezeléssel mintegy 1000 bp értékkel csökkentjük. Ligálás után pEW 1000 plazmidot (21) kapunk, amelyben teljes egészében megtalálható a lac rcpresszor gén, a másolatok száma azonban a csökkentés hatására lényegesen nagyobb, mint a kiindulási plazmidban. A pKK177-3 plazmid helyett a fent említett, kereskedelmi forgalomban lévő pKK223-3 plazmid is alkalmazható a lac rcpresszor beépítésére és kapott termék rövidítésére. A pEW 100 plazmidot (21) EcoRI és Sal I restrikciós enzimmel nyitjuk és (22) fragmenst izoláljuk. A pl59/6 plazmidot (23), amely előállítható a 3 419 995 számú NSZK-beli közrebocsátási irat (0 163 249 számú európai közrebocsátási irat) 4. példája szerint (5. ábra), EcoRI és Sal I restrikciós enzimmel nyitjuk és a kis (24) fragmenst izoláljuk, amely tartalmazza az IL-2 szekvenciát. A (22) és (24) fragmensek ligálásával a pEW 1001 hibrid plazmidot (25) kapjuk. A (25) plazmidot egyrészt EcoRI és Pvul segítségével nyitjuk, amelynek során a (26) fragmenst kapjuk, amely az IL-2 szekvencia nagy részét tartalmazza. Ezt a rész-szekvenciát az ábrán A IL-2 jellel jelöljük. A (25) plazmidot másrészt EcoRI és Pst I segítségével nyitjuk és a nagy (27) fragmenst izoláljuk. A (19), (26) és (27) fragmensek ligálásával, kompetens E. coli MM 294 (ATCC 33625) sejtekkel végzett transzformálással és szelektálásával olyan kiónt kapunk, amely tartalmazza a pW 216 plazmidot (28). A plazmid DNS-t restrikciós és DNS szekvencia analízissel jellemezzük. A (28) plazmidot tartalmazó E. coli sejtek egy éjszakás tenyészetét 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB közeggel (J. H. Miller idézett műve) mintegy 1 : 1000 arányban hígítjuk és a növekedést OD méréssel követjük. OD = 0,5 értéknél a tenyésztőt 1 mmól/1 izopropil-ß-galaktopiranozidra (IPTG) állítjuk, és a baktériumokat 150-180 perc után lecentrifugáljuk. A baktériumokat 5 percen keresztül puffer clcgybcn (7 mól/1 karbamid, 0,1 tömeg% SDS, 0,1 mól/1 nátrium-foszfát, pH = 7,0) főzzük és a mintákat SDS gélcleklroforczis lemezre visszük. Az elektroforézis után a (28) plazmidot tartalmazó baktériumokból proteinsávot kapunk, ami megfelel a várt fúziós protein nagyságának. A baktériumok feltárása (French Press, Dyno-malom) és centrifugálása után a fúziós protein a csapadékban található és így a felülúszóban a visszamaradó proteinek jelentős mennyisége leválasztható. A fúziós pétiéin izolálása után savas hasítással felszabadítjuk az N-terminális végen prolin-kiegészítőt tartalmazó kívánt CSF származékot Ez a származék biológiai tesztekben aktivitást mutatott. A megadott indukciós körülmények rázótenyészetre érvényesek, nagyobb fermentációnál megfelelően megváltoztatott OD értékeket és adott esetben kis mértékben megváltoztatott IPTD koncentrációt célszerű alkalmazni. 3. példa Pro1-CSF (2-127) A (2) fragmens (1. ábra) és a (16) fragmens (2. ábra), valamint a szintetikus (29) DNS szekvencia ligálásával (30) hibrid plazmidot kapunk, amely a szintetikus DNS szekvenciáig a (18) plazmidnak felel meg. A (30) plazmidból Pvu I és Pst I segítségével kihasítjuk a (31) fragmenst, amely tartalmazza a CSF DNS szekvenciát, amelyben azonban az első aminosav kódját prolinkód helyettesíti. A (31) fragmenst (27) és (26) fragmensekkcl ligáivá pW 240 hibrid plazmidot (32) kapunk. Ezt a 2. példában leírt módon E. coliban kifejezve CSF származékot kapunk, amelyben az első aminosavat prolin helyettesíti. Ez a származék is biológiai aktivitást mutat. 4. példa CSF (2-127) A 3’-végén Pst I restrikciós hellyel kiegészített CSF DNS szekvenciát tartalmazó plazmidot, például pHG 23 plazmidot (ATCC 39900) 183 350 sz. európai szabadalmi leírás Sfa Nl-gyel hasítunk és a kiegyenesített (34) plazmidot Klenow-polimcráz és GTP segítségével részlegesen feltöltjük. SÍ nuklcáz segítségével a túlnyúló A nuklcotidot lehasítjuk, majd Pst I segítségével kihasítjuk a (35) fragmenst. A (35) fragmenst szintetikus (36) DNS szekvenciával és (16) fragmenssel (2. ábra) ligáivá kapjuk a (37) plazmidot, amely analóg a (18) plazmiddal. A (37) plazmidból Pvul és PslI segítségével kihasítjuk a (38) fragmenst, ezt (26) és (27) fragmensekkel ligáljuk, miáltal pW 241 plazmidot (39) kapunk. 2. példa szerinti kifejezéssel olyan fúziós proteint kapunk, amely savas hasítás után CSF származékot eredményez, amelyben hiányzik az első aminosav. Ez a származék is biológiailag aktív. 5. példa CSF (6-127) A (33) plazmidot (vagy ennek megfelelő és CSF-DNS szekvenciát tartalmazó plazmidot) először Pstl segítségével teljesen, majd a plazmid DNS-t 1 (ig-ra számolva 8 egység Bst NI enzimmel 37 ‘C hőmérsékleten részlegesen hasítjuk, amikoris a reakciót 5,15,25, 35,45 és 60 perc utón leállítjuk. A 613 bp méretű (40) fragmenst a kapott fragmenselegyből gélelektroforézissel (8 tömeg%-os poliakrilamid gél) elválasztjuk. A megfelelő sávok (összehasonlító anyag: hasítatlan fragmens és HacIII-mal hasított X 179 RF-DNS) különösen a 25 és 35 percen keresztül hasított mintában láthatók jól. A'szintctikus (41) DNS szekvenciát és a (36) DNS szekvenciát (4. ábra) először (42) szekvenciává, majd ezt (16) fragmenssel (2. ábra) és (4) fragmenssel ligáljuk, miáltal pW 212 plazmidot (43) kapunk. A (43) plazmidból Pvu I és Pstl segítségével izoláljuk a (44) fragmenst, amely tartalmazza a CSF származék DNS szekvenciáját. A (44) fragmenst (26) és (27) fragmensekkel ligáljuk, miáltal pW 242 hibrid plazmidot (45) kapunk. 2. példa szerinti kifejezéssel olyan fúziós proteint kapunk, amelyből savas hasítással CSF származék nyerhető, amelyben az első öt aminosav hiányzik. 6. példa CSF (8-127) A szintetikus (36) DNS szekvenciát (4. ábra) először szintetikus (46) DNS szekvenciával, majd az így kapott (47) DNS fragmenst (40) és (16) fragmenssel ligáljuk, amelynek során (48) hibridplazmidot kapunk. Ebből 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
