202584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GM-CSF-fehérje-származékok és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 202 584 B 4 kus DNS szekvencia kiválasztása és a fúziós protein hasítása tehát csak a találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módjának tekinthető, amely az ismert módon változtatható. Azt találtuk, hogy az interleukin-2-t kódoló DNS nyílt leolvasó szakasza különösen előnyösen alkalmazható peptidek, illetve proteinek kifejezése során segédanyagként, és fúziós proteinek előállításához különösen alkalmas az Ile IL-2 N-terminális vége, amely lényegében az első 100 aminosavat tartalmazza. Primer termékként tehát olyan fúziós proteint kapunk, amely teljes egészében vagy túlnyomórészben eukarióta protein szekvenciából áll. Meglepő módon a gazda proteázok ezt a proteint nem tekintik idegennek, és nem bontják le rögtön. További előny, hogy a találmány szerinti fúziós proteinek nehezen oldódnak vagy oldhatatlanok és így egyszerifen, például centrifugálással elválaszthatók az oldható proteinektől. Mivel a fúziós protein a találmány értelmében ballaszt részként szolgál, nincs szükség arra, hogy az IL-2 rész biológiailag aktív molekula legyen, és így az IL-2 exakt szerkezete nem meghatározó. Elegendő, ha lényegében az első 100 N-terminális aminosav jelen van. Lehetséges tehát például az is, hogy az N-terminális végen olyan változtatásokat hajtunk végre, amelyek lehetővé teszik a fúziós protein hasítását, ha a kívánt proteint N-terminálisan hozzákapcsoltuk. Megfordítva, C-terminális változtatások is lehetségesek, a kívánt protein lehasításának lehetővé tételéhez vagy megkönnyítéséhez. A humán IL-2-t kódoló természetes DNS szekvencia a 0 091 539 számú európai közrebocsátási iratból ismert. Az ott megadott irodalom egér és patkány IL-2-re is vonatkozik. Ezek az emlős DNS-k felhasználhatók a találmány szerinti proteinek előállításához. Előnyösen azonban szintetikus DNS-t, elsősorban humán IL-2-t kódoló DNS-t alkalmazunk, amelyet a 3 419 995 számú NSZK-bcli közrebocsátási irat, illetve a 0 163 249 számú európai közrebocsátási irat ismertet. Ez a szintetikus DNS nemcsak azzal az előnnyel rendelkezik, hogy a kód kiválasztásban figyelembe lehet venni a gazdaként leggyakrabban alkalmazott E. coli adottságait, hanem egy sor hasítási helyet is tartalmaz különböző restriktoendonukleázokhoz a szekvencia elején, illetve a 100. triplet szakaszában, amelyek a találmány értelmében felhasználhatók. Ez azonban nem zárja ki azt, hogy a DNS közbeeső szakaszában különböző változtatások történjenek, amelynek hatására további hasítási helyek is felhasználhatóvá válnak. Ha a Ban II, Sac I vagy Sst I nukleázokat alkalmazzuk, úgy olyan IL-2 rész-szekvenciát kapunk, amely mintegy 95 aminosavat kódol. Ez a hossz általában elegendő egy oldhatatlan fúziós protein előállításához. Ha a rossz oldékonyság például a kívánt hidrofil CSF származéknál még nem kielégítő, de a lehető legkevesebb ballaszt előállítása érdekében a C-terminális véghez közel eső hasítási helyeket nem kívánjuk alkalmazni, úgy a DNS szekvenciát az N- és/vagy C-terminális végén megfelelő adapterrel, illetve linkerrel hosszabbítjuk meg, és így a ballaszt részt „méretre szabjuk”. A DNS szekvencia természetes többé-kevésbé teljes hosszában kihasználható és így adott esetben módosított, biológiailag aktív IL-2-t kapunk melléktermék formájában. A találmány szerint előállított fúziós protein (la) vagy (Ib) általános képlettel ábrázolható, Met-X-Y-Z (la) Met-Z-Y-X (Ib), a képletben X jelentése lényegében azonos az előnyös emberi IL-2 mintegy első 100 aminosavjának szekvenciájával, Y jelentése közvetlen kötés, ha a kívánt proteinnel szomszédos aminosav vagy aminosav szekvencia a kívánt protein lehasítását lehetővé teszi, illetve egy vagy több genetikusán kódolható aminosavból álló híd, amely a lehasítást lehetővé teszi, Z jelentése genetikusán kódolható aminosavak szekvenciája, amely azonos a kívánt GM-CSF-származékkal. Mint ez az (la) és (Ib) képletekből adódik, és mint ezt már korábban említettük, a kívánt protein kifejezhető az IL-2 szakasz előtt és után. Egyszerűség kedvéért a következőkben a második lehetőséget ismertetjük, ami megfelel a fúziós proteinek előállításának szokásos módjával. Ha tehát a következőkben ezt a klasszikus változatot ismertetjük, az nem jelenti a másik alternatíva kizárását A fúziós protein hasítását önmagában ismert módon kémiailag vagy enzimatikusan végezzük. A megfelelő módszer kiválasztása a kívánt protein aminosav szekvenciájától függ. Ha Y olyan hídelemet jelent, amely karboxiterminális végén triptofán, illetve metionin áll vagy Y Trp-t, illetve Met-et jelent, úgy N-bróm-szukcinimid, illetve halogén-cián segítségével kémiai hasítás végezhető, ha olyan CSF származékot szintetizálunk, amely a fenti aminosavakat nem tartalmazza. Az olyan CSF és származékai, amely aminosav-szekvenciájában Asp-Pro szakaszt tartalmaz, és kellően sav-stabil, önmagában ismert módon proteolitikusan hasítható. így olyan proteint kapunk, amely N-terminális végén prolim, illetve C-terminális végén aszparágin-savat tartalmaz. Ily módon tehát módosított proteinek is szintetizálhatók. Az Asp-Pro kötés savval szemben labilis is lehet, ha a szakasz (Asp)„-Pro, illetve Glu-(Asp)n-Pro képlettel ábrázolható, ahol n értéke 1-3. Az enzimatikus hasítás szintén ismert. Ehhez felhasználhatók fokozott specifikussággal rendelkező módosított enzimek is [C. S. Craik és munkatársai: Science 228,291-297 (1985)]. A fúziós proteint baktériumos kifejezőrendszerben végzett ismert kifejezéssel nyerjük. Ehhez bármely inert gazdavektor-rendszer, így Streptomyces, B. subtilis, Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens, elsősorban E. coli baktériumok alkalmazhatók. A kívánt proteint kódoló DNS szekvenciát önmagában ismert módon egy vektorba építjük be, amely biztosítja a jó kifejezést a választott kífejezőrendszerben. Ehhez célszerűen a k fág trp, lac, tac, PL vagy PR csoportjába tartozó promotort és operátort vagy szintetikus promotort, például a 34 30 683 számú NSZK-beli közrebocsátási iratban, illetve a 0 173 149 számú európai közrebocsátási hatban ismertetett promotort választjuk. Előnyösen alkalmazható a tac promotor operátor szekvencia, amely a kereskedelemben hozzáférhető (például pKK223-3 kifejező vektor, Pharmacia, „Molekular Biologicals, Chemicals and Equipments for Molecular Biology, 1984,63). A találmány szerinti fúziós proteinek kifejezése során bizonyos esetekben célszerű lehet az ATG-start jel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
