202584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GM-CSF-fehérje-származékok és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202 584 B 2 A találmány tárgya eljárás GM-CSF-fehéijeszármazékok előállítására. A humán granulocita makrofág „Colony-Stimulating” faktor (GM-CSF) egy flikoprotein, amelynek móltömege mintegy 23 000 Dalton. A glikoprotein cDNS szekvenciája és emlős sejtben történő kifejezése ismert [G. G. Wong és munkatársai: Science 228, 810- 815 (1985); D. Metcalf: Science 229,16-22 (1985)]. Meglepő módon azt találtuk, hogy a humán GMCSF protein (a továbbiakban ,,CSF’ néven jelölve), baktériumban történő kifejezése biológiailag aktív terméket eredményez. A CSF ily módon gyógyszerként felhasználható. A találmány tárgya tehát eljárás CSF előállítására prokariotában, elsősorban E. coliban történő kifejezéssel. Ehhez az ismert cDNS szekvenciát alkalmazzuk, amely az ismert módon, előnyösen szintézissel előállítható. A találmány tárgya továbbá eljárás a prokariotában elsősorban E. coliban alkalmazható kifejező vektor előállítására, amely CSF, illetve CSF fúziós proteint kódoló DNS-t tartalmaz megfelelő elrendezésben (operatively linked to). Fúziós protein vektorjának előállításához hasítási helyek építhetők be, amelyek a CSF protein lchasítása után az aminosav szekvenciában C-terminális és/vagy N-teiminális változásokat mutatnak. Ezek a proteinek gyógyszerként felhasználhatók. A CSF proteinek és biológiailag aktív származékai előnyösen alkalmazhatók a haematopoetikus sejtek proliferációjának stimulánsára és a granulocita és makrofág képzés gyorsítására. A találmány további részleteit és előnyös kiviteli alakjait a következő leírás, illetve a szabadalmi igénypontok tartalmazzák. A találmány magyarázatául szolgálnak az 1-15. ábrák, amelyek az azonos számú példa egyes lépéseit mutatják be. Az ábrák, elsősorban a polilinker vonatkozásában, nem méretarányosak. Az 1. ábra és az ezt folytató la. és lb. ábrák a pW 225 vektor előállítását mutatják be, amely a (Met-) CSF közvetlen kifejezését szolgálja. A következő ábrák olyan vektorokra vonatkoznak, amelyek a fúziós proteint fejezik ki, amelyekben a CSF amino szekvencia N-terminálisán egy ballaszt protein van beépítve, amely a humán interleukin-2 (a következőkben IL-2, illetve AIL-2) rész-szekvenciájából vezethető le. A 2. ábra és az ezt folytató 2a. és 2b. ábrák a pW 216 vektor előállítását mutatják, amely olyan fúziós proteint kódol, amelyből savas hasítással CSF származék nyerhető, amely N-terminálján prolin-aminosavval van meghosszabbítva. A 3. ábra a pW 240 vektor szintézisét mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amely savas hasítás után CSF származékot eredményez, amely az első aminosav (alanin) helyén prolint tartalmaz. A4, ábra a pW 241 vektor előállítását mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amely savas hasítással CSF származékká alakítható, amelyben az első aminosav (alanin) hiányzik. Az 5. ábra a pW 242 vektor előállítását mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amely savas hasítással CSF származékká alakítható, amelyben az első öt aminosav eliminálódott A 6. ábra pW 243 vektor előállítását mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amely savas hasítással CSF származékká alakítható, amelyben az első hét aminosav hiányzik. A 7. ábra pW 244 vektor szintézisét mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amely savas hasítással CSF származékká alakítható, amelyben az első tizenegy aminosav eliminálódott. A 8. és az ezt folytató 8a. ábra pW 246 vektor szintézisét mutatja. Ez olyan fúziós proteint kódol, amelyben az IL-2 rész-szekvenciát két megváltoztatott, CSF’ jelű szekvencia követi. Savas hasítással olyan CSF származékot kapunk, amelyben az N-terminális első aminosav előtt prolin áll és amelyben az utolsó aminosav helyett aszparáginsav található. A 9. ábra pW 247 vektor szintézisét mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amelyben az IL-2 részszekvenciát három CSF’ szekvencia követi. Savas hasítás után a 8. ábrában jellemzett CSF származékot kapjuk. A 10. ábra és az ezt folytató 10a. ábra a pS 200-204 hibridplazmidok előállítását mutatja, amelyek szintetikus CSF-DNS rész-szekvenciákat tartalmaznak, ahol a pS 200 plazmid a I. melléklet szerinti I. szintézisblokkot, a pS 201 plazmid a II. melléklet szerinti II. szintézisblokkot, a pS 202 plazmid a ül. melléklet szerinti III. szintézisblokkot, a pS 203 plazmid a teljes szintetikus gént tartalmazza és a pS 204 plazmid egy kifejező plazmidot jelent, amely szintén a teljes szintetikus CSF-DNS szekvenciát tartalmazza. Kifejezés és savas hasítás után a 2. ábrán leírt CSF származékot kapjuk. A 11. ábra és az ezt folytató 11a. ábra a pS 207 kifejező plazmid szintézisét mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amely N-bróm-szukcinimiddel történő hasítással CSF származékká alakítható, amelyben a 13 és 122 pozícióban a Trp-t His helyettesíti. A 12. ábra szintetikus DNS rész-szekvenciát mutat, amely olyan CSF származék előállítását teszi lehetővé, amelyben a 100 pozícióban az Ile-t Thr helyettesíti. A13. ábra és az ezt folytató 13a. ábra pS 210 kifejező plazmid szintézisét mutatja, amely olyan fúziós proteint kódol, amely brómeián hasítás után CSF származékká alakítható, amelyben valamennyi metionin maradékot semleges aminosav helyettesít, vagyis a 36 helyzetben Ile és a 46,79 és 80 helyzetekben Leu. A 14. ábra olyan DNS szekvencia szintézisét mutatja, amely a 13. ábra szerinti szintézis szerint CSF származék előállítását teszi lehetővé, amelyben a 36 helyzetű metionint lie, a 46 helyzetű metionint Leu helyettesíti és a 79 és 80 helyzetű aminosavak helyett egy darab Leu maradék áll. A 15. ábra olyan szintetikus DNS-t mutat, amely a 13. ábra szerind szintézissel olyan CSF származék előállítását teszi lehetővé, amelyben a 36 helyzetű meüonint Ile és a 46 helyzetű metionint Leu helyettesítí és a 79 és 80 helyzetű két aminosav hiányzik. Az ábrákban, illetve a példákban megadott változatok természetesen csak néhány példát sorolnak fel a találmány szerint lehetséges nagyszámú átalakításra. Itt a fúziós proteinek ballaszt részeként bármely más protein szekvencia, elsősorban baktériumos szekvencia az ismert módon felhasználható, és a fúziós proteinek kapcsolására és hasítására bármely szokásos módszer alkalmazható, amelynek során molekulájában vagy a molekula két végén eltérő aminosav sorrenddel rendelkező CSF származékok állíthatók elő. Az IL-2 és a szinteti5 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
