202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
17 HU 202 582 B 18 gálóoldatot35 “C-os vízfürdőn percenként60-at forduló rázógépen rázatjuk, 4-5 órán át, illetve amíg a legtöbb csomó diszpergálódik. A nagyobb törmelékek eltávolítására a diszpergált szövetet, melyet 0,02% (vegyes%) DN-ázzal (dezoxi-ribonukleáz I, Sigma Chemical Co.) 5 keverünk, Nitex szöveten (hálóméret 153 pm, Tetko Co., Elmsford, N.Y.) át szűrjük. A nem emésztődött csomókat összegyűjtjük és 0,05% (vegyes%) pronázoldatban (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA) szuszpendáljuk, majd percenként 40 fordulattal rázatjuk 10 35 ‘C-on, további 15 percig. Az emlőszövetet újraszűrjük, centrifugálással összegyűjtjük, Medium 199-cel mossuk, és a sűrűséggradiens centrifugálásig jégben tároljuk. Az enzimes disszociáltalást követően az emlős sző- 15 vetdarabokat 1 ml 0,02%-os DN-áz oldatban szuszpendáljuk, majd előre elkészített Percoll (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ.) gradiensre rétegezzük, amint azt Richards és munkatársai leírják. Röviden, 30 ml 42%-os Percollt 1 órán át 20 000 g-n centrifugál- 20 juk, hogy folytonos koncentráció-gradienst állítsunk elő. 3 x 107 sejtet rétegezünk c gradiens tetejére, és 10 percig 800 g-n centrifugálunk. Az epiiéliális jellegű sejteket a gradiens 1,065- 1,070 g/ml sűrűségű régiójából gyűjtjük össze. 25 A tenyésztés előtt sejtszámbecsléshez egy rész sejtszuszpenziót keverünk kilenc rész 0,02% (tf%) kristályibolyát tartalmazó 0,1 mólos citromsavval. A megfestett sejtmagokat hemocitométerrel számoljuk. A kollagéngél tenyésztési rendszer alaptechnikáit 30 Yang és Nandi írták le. A kollagéngélt Michalopoulos és munkatársai leírása alapján némi módosítással (Richards és munkatársai) készítettük. Röviden, 4 g sterilezett patkányfarok kollagén rostot (elsősorban Type 1-et) 1 1 steril 0,017 mólos ecetsavban 4 °C-on, 48 órán át 35 10 000 g-vel 60 percig centrifugáljuk, majd a felülúszót összegyűjtjük, és ezt használjuk a továbbiakban kollagén törzsoldatként. Minden tétel kollagént külön-külön 7,4 pH-ig titrálunk, 2:1 arányú 10 X Medium 199 (bikarbónát nélkül) (GIBCO)- 0,34 N NaOH oldatot használva. A kollagén mátrixban történő sejttenyésztéshez a semlegesített kollagénkeveréket jégen tartjuk, hogy megelőzzük a gélesedést. Az epitéliális jellegű sejteket a lehető legkisebb mennyiségű (0,5 ml) Medium 199- ben adjuk hozzá, 4-6 x 105 sejt/ml elegy végkoncentrációt kapva. A kollagénsejt szuszpenziót (0,5 ml) 0,3 ml előre gélesített kollagénre rétegezzük, a 24 lyukas tenyésztőlemez (Costar, Cambridge, Mass.) minden egyes lyukában, majd szobahőmérsékleten hagyjuk gélcsedni. Miután e réteg megdermedt, a tenyészetet 0,5 ml olyan 1:1 arányú Dulbecco’s Modified Eagle’s (DME): Items F- 12 (DME/F12) (GIBCO) tápoldattal tápláljuk, amely 3% (tf%) FBS-sel, 10 mg/ml egér epidermális növekedési faktorral (EGF) (Collaborative Research, Inc., Waltham, Mass.) antibiotikumokkal (GIBCO) és a megfelelő vizsgálandó növekedési faktorral van kiegészítve. A tenyészeteket 37 °C-on 95% levegő - 5% C02 atmoszférában inkubáljuk, és a tápoldatot minden másnap cseréljük. A blGF-II-nek a szarvasmarhaemlő epitéliális sejtjei sejtosztódását serkentő hatását a kollagén-gél vizsgálati rendszerben széles koncentrációtartományban, három párhuzamost véve, vizsgáljuk. Eredményeinket a IV. táblázatban közöljük. Negatív sejtosztódási kontrollt - Basal Medium (DME/F-12 + 3% (vegyes%) FCS + EGF) 10 mg/ml - és poziü'v sejtosztódási kontrollt - különböző, a fiziológiásnál magasabb koncentrációban inzulin - is bevontunk a vizsgálatba. Amint azt a IV. táblázat mutatja, a bIGF-II statisztikailag szignifikáns szinten, körülbelül 30 mM-tól körülbelül 100 mM-ig terjedő koncentrációtartományban serkenti a szarvasmarhaemlő epitéliális sejtjeinek osztódását. IV. táblázat 1. számú vizsgálat Kezelés Koncentráció Sejtszám/tenyészlemezlyuk (X 104) Átlag standard deviáció %-os növekmény a kontrolihoz képest bIGF-II 0,1 nM 29,5 28,8 19,9 26,1 5,4 — 1,0 nM 30,1 24,4 29,4 27,9 3,1 — 3,3 nM 29,0 22,4 18,6 23,3 5,3 — 10,0 nM 35,6 41,3 38,4 38,4 2,9 30,2 33,0 nM 42,2 46,4 — 44,3 2,9 50,2 100,0 nM 57,8 57,1 58,7 57,8 0,8 95,9 Inzulin 17,0 nM 31,5 35,9 34,7 34,1 2,3 15,6 170,0 nM 51,2 45,4 57,4 51,4 6,0 74,2 1700,0 nM 38,7 56,9 68,5 54,7 15,0 85,4 Kontroll*’ 29,4 29,7-29,5 0,25-*’ = Alap-tápoldat A második vizsgálatban az 1. példában leírt HPLC csúcs anyagát 20%-os ecetsavban oldjuk 165 pM-os becsült koncentrációban, majd közvetlenül ugyanehhez a Basal Medium (alap-tápoldat)-hoz adjuk, kétféle törzsoldatot készítve. Az első törzsoldat 33,6 pl bIGF-II-ol- 65 datot és 11,1 ml Basal Medium-ot tartalmaz (a bIGF-II végső koncentrációja 500 nM). A második törzsoldat 6,7 pl bIGF-II oldatot és 11,1 ml Basal Medium-ot tartalmaz (a bIGF-II végkoncentrációja 100 nM). Sorozathígításokat készítünk e törzsoldatokból és a 0,1 nM-10
