202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
19 HU 202 582 B 20 lói 100 nM-ig terjedő koncentrációtartományban vizsgáljuk azokat A kontroll (apóidat Basa Medium-ot és ha szükség van rá, megfelelő mennyiségű ecetsavat tartalmaz (ha a növekedési faktor hozzáadása csökkenti a tesztoldat pH-ját, akkor a megfelelő pH-jú kontroll alkalmazására van szükség). Valamennyi tápoldat pH-ját semlegesre állítjuk be 10%-os NaOH oldattal. 2. vizsgálat iGF-n koncentráció Kontroll0 Sejtszám/tenyészlemez lyuk (X 104) áüag Standard deviáció %-os növekedés a kontrolihoz képest 100 nM 2 37,9 43 34,8 38,6 4,1 94,0 50 nM 3 35,9 38,9 37,9 37,5 1,5 76,1 10 nM 1 33,8 39,9 38,9 37,5 3,3 30,6 5 nM 1 34,8 29,8 39,9 34,8 5,1 21,2 1 nM 1 33,8 33,8 35,9 34,5 1,2 20,2 0,5 nM 1 22,7 25,7 30,8 26,4 4,1-0,1 nM 1 26,7 29,8 — 28,2 2,1-1 — 29,8 31,8 24,7 28,7 3,7-2 — 21,6 18,6 19,6 19,9 1,6-3-19,6 24,7 19,6 21,3 2,9-*>_ 4. példa 5 Az alábbiakban megadott eljárások során használt restrikciós és DNS módosító enzimeket a New England Biolabs (Beverly, MA) állította elő. Hacsak külön nem jelezzük, az egyes klónozási és szekvenciálási lépések során azokat a standard molekuláris biológiai eljáráso- 10 kát alkalmazzuk, melyekre Maniatis és munkatársai utalnak, illetve írnak le. Agenomiális DNS-tborjúveséből izoláljuk, Maniatis (280-281. oldal) leírása szerint. Azokat a DNS próbákat, melyeket a később leírásra kerülő genomiális Southern 15 analízis és a szarvasmarha génbank átvizsgálása során használunk, a következőképpen izoláljuk. A Bell és munkatársai, valamint Dull és munkatársai által leírt emberi IGF-II DNS-hez strukturálisan hasonló kiónt az 1. ábrán vázolt, a cDNS-t tartalmazó, 1,7 kilobázispár 20 (kbp) méretű, EcoRI fragmensnek a pUC18 plazmid vektorba történő klónozásával nyerjük. Az inszert DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel való emésztéssel, majd az ezt követő 0,7 % agarózban történő elektroforézissel méret szerint frakcionálva különítjük el a vektor szekvenciáktól (Maniatis, 150-161. oldal). A DNS-t etidiumbromid-oldattal (1 pg/ml) festjük, hosszúhullámú UV- fényben láthatóvá tesszük, és az 1,7 kbp méretű csíkot kivágjuk. A DNS-t elektroclucióval (Maniatis, 164. oldal) nyerjük vissza, majd elutip oszlopon (Schleicher és Schnell, Keene, NH) tovább tisztítjuk a gyártó ajánlásai szerint. Ezt az 1,7 kbp méretű fragmenst emésztjük Rsal restrikciós enzimmel, amikor az 1. ábrán jelzett fragmenseket kapjuk. Ezeket a fragmenseket ugyanúgy tisztítjuk, amint azt az 1,7 kbp méretű fragmensnél leírtuk (Maniatis, 150-164. oldal). Az emberi IGF-II prepeptidet teljes egészében kódoló szekvenciákat valószínűleg tartalmazó, 340 és 515 bázispár méretű fragmenseket használjuk azután az alábbiakban leírt genomiális Southem-analízisre és a szarvasmarha génbank átvizsgálására. EcoRI Rsal IRsal EcoRI L 340 bp j 515 bp |_______>800 bp_____________j hIGF-II Dömének B,C,A D,E 3’-nem transzlatálódó IGF-IIA 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 AA Phe Arg Ser Cys Asp Leu Alá Leu Leu Glu Thr Humán 5’ ITC CGC AGC TGT GAC CTG GCC CTC CTG GAG ACG 3’ próba 3’ AAG GCG TCG ACA CTG GAC CGG GAG GAC CTC TG 5’ IGF-IIB 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 AA Alá Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu humán 5’ GCT TAC CGC CCC AGT GAG ACC CTG TGC GGC GGG GAG 3’ próba 3’ CGA ATG GCG GGG TCA CTC TGG GAC ACG CCG CCC C 5’ 11
