202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
3 HU 202 582 B 4 rásokkal szolgái, melyek ezen peptidek előállítását a fentebb leírt DNS molekulák kifejeződése, a keletkezett peptidek kinyerése, majd az esetleges további, lényegében tiszta alakig történő tisztítása útján teszik lehetővé. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást. Az itt alkalmazott aminosav (például Alá az alaninra) és nukleinsav (C, A, G vagy T) jelölések megegyeznek a konvencionálisán alkalmazott jelölésekkel (Lásd: Lehninger (1976)). A leírásunkban használt „szintetikus peptid” megnevezés olyan peptideket jelöl, melyeket valamely olyan technikával állítottunk elő, amely különbözik az illető peptid élő állatban történő természetes keletkezési módjától (például kémiai szintézis vagy rekombináns DNS kifejezése). Ennek megfelelően, a jelen találmány szerinti „szintetikus” peptideket megkülönböztetjük azoktól a peptidektől, melyeket az illető állat a benne természetes módon megtalálható DNS molekulák kifejezése útján állít elő. Ily módon előállítva tehát ezek a szintetikus peptidek általában mentesek a szarvasmarha- (és rendszerint egyéb állati) eredetű peptidektől. Más megközelítésben azonban a találmány szerinti peptideket élő állatok által termelt peptidkeverékből történő izolációval is elő lehet állítani, amint azt az 1. példában bemutatjuk. Bármilyen módon is végezzük azonban a találmány szerinti peptidek elkülönítését, a szarvasmarha- vagy más állati eredetű egyéb peptidektől, az így kapott peptid alapvetően mentes az egyéb peptidektől, azaz a preparátum csak olyan kis mennyiségű egyéb peptidet tartalmaz, hogy ezek nem módosítják lényegesen a találmány szerinti peptid kívánatos biológiai hatását. Az alábbiakban előforduló, gyakorlatilag a bIGF-II szekvenciáját (önmagában vagy akár mindkét, akár am ino-, akár karboxil-vége felől kiegészítve) tartalmazó peptidek megjelölés olyan peptidekre vonatkozik, melyek az imént leírt szekvenciát vagy legalábbis ennek akkora részét tartalmazzák, amely a bIGF-II egy vagy több biológiai hatásának létrejöttéhez lényeges mértékben szükséges (általában a tiszta, intakt bIGF-II aktivitásának legalább 0,1%-a, de inkább legalább 1%-a, vagy még előnyösebben legalább 10%-a). A bIGF-II-nek biológiai hatásai - de nemcsak ezekre korlátozva - az inzulinszerű aktivitás és (önmagában vagy más, biológiailag aktív anyagokkal együtt) az állati sejtosztódást vagy a preformált emlő epitéliális sejtek laktációját serkentő aktivitás. Azok az aminosavak, melyek ezen aktivitások szempontjából feleslegesek, elhagyhatók, így a fentebb leírt pepiidnél kevesebb aminosavat tartalmazó peptid keletkezik. E fogalomkörbe tartoznak az imént leírt bioaktivitással rendelkező peptidek, tekintet nélkül arra, hogy a bIGF-II vagy természetes prekurzorai fentebb közölt aminosav-szekvenciájában egy vagy több aminosavat más aminosavval helyettesítünk-e. Azok a peptidek például, melyekben a fentebb közölt szekvenciájú bIGF-II amino-terminális alaninját metioninra cseréljük, várhatóan bIGF-II-szerű aktivitással fognak rendelkezni, és könnyen termeltethetők rekombináns DNS molekulákkal (rDNS) baktériumokban, vagy más olyan mikroorganizmusokban, melyek nem távolítják el az N-terminális metionin csoportot. Ugyancsak e fogalomkörbe tartoznak azok a különböző nagyobb méretű peptidek, melyek a fenti szekvenciát (vagy annak deléciós vagy valamely szubsztitúciós változatát) tartalmazzák amino- és/vagy karboxil-terminális végükhöz egy vagy több további aminosavat közvetlen kapcsolva. Ideértjük azokat a peptideket is, melyek végükön vagy másutt, más módon vannak módosítva, így például glikozilálva, foszforilálva, amidálva, azzal a megszorítással, hogy ezeket a peptideket (további módosítással vagy anélkül) jelentős bioaktivitású bIGF-II előállítására lehessen felhasználni. Az itt közölt bIGF-II aminosav-szekvencia azonosításának egyik módja a bIGF-II izolálása és tisztítása szarvasmarha szérumból. Habár az IGF a legtöbb állatban elsősorban a májban termelődik, IGF-eket igen sok szövetben kimutattak, így például izomban, porcban, agyban és agyi spinális folyadékban, mégis a szérum az IGF-ek legáltalánosabb fonása, az IGF-II-é pedig különösen. IGF-ck elkülönítésére és izolálására alkalmas módszerek már ismertek az irodalomból, lásd például Svoboda és munkatársai, Van Wyk és munkatársai, Liberti, Bala és munkatársai, és Zumstein és munkatársai közleményeit. A szarvasmarhaszérumból jelen leírás szerint izolált és tisztított aktív IGF-II egyszerű, 7400 dalton móltömegű és a fentebb bemutatott, 67 aminosavból álló szekvenciát tartalmazó peptid. A tisztított bIGF-II-höz kötött biológiai aktivitás előzetes vizsgálatát, illetve ennek mennyiségi mérését a patkány méhlepény radioreceptor vizsgálattal végeztük, ahogy azt Daughaday és munkatársai leírják. A bIGF-II aminosav-szekvenciájának itt közölt teljes leírása azért is fontos, men ez alapjául szolgál olyan peptidek előállításának, melyek bIGF-II aktivitással rendelkeznek. Az előállítást bármely rendelkezésre álló módszerrel végezhetjük, így kis (például kutatási célokat szolgáló) mennyiségeket hagyományos peptidszintetizáló berendezésekkel lehet előállítani. Nagyobb mennyiség előállítását kémiai szintézissel, vagy rendszerint még hatékonyabban, a találmány szerinti peptideket kódoló rDNS molekulákat mikroorganizmusokkal vagy sejtkultúrákkal hasznosíttatva végezzük. Az ún. génsebészeti technikák segítségével hasznosítva az ilyen DNS molekulákat, a fenti peptidekből sokkal nagyobb mennyiségeket lehet előállítani, mint azt szarvasmarhaszérumból vagy szövetekből kinyerni valaha is lehetséges volna. Amint azt a későbbiekben részletesen is leírjuk, a bIGF-II aminosav-szekvenciáját sikerült a szarvasmarhavese genomiális DNS-ből származó bIGF-II génfragmensek izolálásával és jellemzésével megerősítenünk. A génazonosítást megelőzően azonban már sikerült olyan szintetikus peptideket előállítani az IGF-II itt közölt aminosav-szekvenciája felfedezését követően, melyek szerkezeti szempontból megfeleltek a bIGF-II-nek, az előállítás során elsősorban az adott aminosav-szekvencia kódolására előállított rDNS molekulákat felhasználó technikákat alkalmazva. Amikor rDNS-t felhasználva mikorbiológiai gazda mikroorganizmusokban, például baktériumokban vagy élesztőben termelünk adott peptideket, az adott aminosav-szekvenciát kódoló és a választott gazda mikroorganizmus által preferált bIGF-II kodonokból (lásd: Italaira, 4 356 270 számú amerikai szabadalmi teúás, 1982. 10. 26.) összeállított DNS szekvenciát tervezünk és állítunk elő szintetikusan. A jelen találmány szerinti peptideket rDNS és/vagy kémiai szintézis útján előállítva 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
