202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
5 HU 202 582 B 6 az aminosav-összetételben kisebb eltérések jöhetnek létre. Például, a baktériumokkal termelve egy metionin csoport jelenik meg, az amino N-terminális végen, míg a kémiai szintéziskor a karboxil C-terminális módosulhat úgy, hogy itt -CORj, -CR^, -CONHNR!, - CONR^z vagy -CN2OR (Rj és R2 alkilcsoport vagy hidrogénatom) csoportok találhatók. Ezek a peptidek jelen találmány oltalmi körébe tartoznak mindaddig, míg bIGF-II-szerű biológiai aktivitásuk nem csökken elfogadhatatlan mértékben. Néhány esetben a találmány szerinti pcptidckct denaturált, biológiailag inaktív formában izolálhatjuk, illetve különíthetjük el. Természetes, biológiailag aktív (nem denaturált) formájában a bIGF-II három diszulfid-híd keresztkötést tartalmaz. Az emberi IGF-II és IGF-I analógiájára, ezek a hidak valószínűleg a 9. és 47., 21. és 60., valamint a 46. és 51. aminosav (cisztein) pozíciók között találhatók (lásd: Yamashiro és munkatársai), habár a találmány oltalmi köre nem korlátozódik erre. Azokat a találmány szerinti pcplidcket, melyek nem tartalmazzák ezeket a szükséges keresztkötéseket, aktiválni lehet az irodalomból jól ismert pcptid-rcnaturációs technikákkal, rendszerint olyan körülmények (például hőmérséklet, oxidáló környezet stb.) között, ahol a peptidek elnyerik biológiai aktivitásukat, háromdimenziós szerkezetüket és a biológiailag aku'v bIGF-II-re hasonlító diszulfidhíd kötések alakulnak ki. A használt technika mindaddig nem meghatározó a találmány szempontjából, amíg a biológiai aktivitás a kívánt mértékben létrejön. Az emberi, a patkány és szarvasmarha IGF-II-k közötti aminosav-szekvencia-különbségek elsősorban a molekulák C alegységnek nevezett régiójában találhatók. A találmányunk céljai érdekében analizált bIGF-II minden esetben alanint tartalmazott az N-terminális végen, ahogy azt a II. táblázatban bemutatjuk. Ez megfelel az emberi és patkány IGF-II-knél Humbel által leírt N-terminális alaninnak, de eltér az emberi IGF-II Rinderknecht és munkatársai, illetve a patkány IGF-II Marquardt és munkatársai leírásai szerinti N-terminális tirozint tartalmazó bIGF-II-ktől. Az N-terminális tirozint tartalmazó bIGF-II molekulák az itt használt szarvasmarhaszérumból nem kimutatható alléi és/vagy izolálási variációk eredményeképpen, vagy a tisztítás során véletlenül bekövetkező N-terminális alanin-dcléció következtében jöhetnek létre. Akárhogy is, az ilyen N-tirozin variánsok a találmányunk szerinti peptidek ekvivalenseinek tekinthetők, mindaddig, míg bIGF-II-szerű biológiai aktivitást mutatnak. A bIGF-II itt közölt aminosav-szekvenciájának és biológiai aktivitásainak felhasználásával lehetővé válik a bIGF-II allélikus formáinak azonosítása és/vagy olyan bIGF-II variánsok létrehozása, amelyek biológiai aktivitása azonos vagy meghaladja a blGF-II-ét. így előre látható, hogy a bIGF-II alléi formáinak izolálása és aminosav-deléció(ka)t, szubsztitúció(ka)l, és/vagy addíció(ka)t hordozó bIGF-II variánsok létrehozása olyan különböző hasznos peptidekhez vezethet, melyeket itt leírunk. Ilyen alternatív peptideket a témában jártas szakember könnyen azonosít A továbbiakban leírt DNS szekvenálás és a humán IGF-II („hIGF-II”)-vel való analógia alapján úgy gondoljuk, hogy a bIGF-II először intracellulárisan, egy prekurzor peptid alakjában szintetizálódik, ez közvetlenül az érett bIGF-II N-terminális vége előtt egy legalább 24 aminosavból álló szignál-szekvenciát tartalmaz, és ez a szignálszekvencia, miközben a prekurzor peptid a bIGF-II-t termelő sejtekből kiválasztódik, lehasad. Az ilyen szignál-szekvenciát (vagy annak bármely kívánt részét) tartalmazó, találmány szerinti peptideket a megfelelő DNS kifejeztetésével lehet termeltetni [először kiejtve az(oka)t a kodon(oka)t, amely(ek) a szekvenciában nem kívánatos aminosav(aka)t kódolják], és ezek a peptidek jól hasznosíthatók a találmány szerinti, az érett bIGF-II aminosav-szekvenciájával megegyező szekvenciájú peptidek termeltetésében, például a szignál-szekvencia kémiai, mikrobiológiai vagy enzimatikus eltávolítása útján. Az itt tárgyalásra kerülő más, új DNS-szekvenciák alapján úgy tűnik, hogy létezik a karboxil-terminális végtől körülbelül 89 aminosavat tartalmazó szakaszt hordozó bIGF-II prekurzor peptid. E szakasz első 68 aminosavának új szekvenciáját (a bIGF-II karboxil-terminális vége felől kezdve) az alábbiakban közöljük. A proinzulin analógiájára úgy hisszük, hogy e karboxilterminális vég felőli szakaszt tartalmazó peptidek lényeges mértékben hordozzák a bIGF-II biológiai aktivitását, és így ezek a hosszabb peptidek is a jelen találmány oltalmi köréhez tartoznak. A találmány szerinti peptidek felhasználását az alábbiakban ismertetjük. Amint azt az alábbiakban részletesebben is leírjuk, a jelen találmány szerinti bIGF-II izolálása és a bIGF-II jellemzése kedvező alkalmat teremtett a bIGF-II biológiai aktivitásának egyértelműbb azonosítására és e hatás jellegének meghatározására. Úgy találtuk például, hogy a bIGF-II aktív a patkány L6 mioblaszt sejtosztódásvizsgálat során, valamint a szarvasmarhaemlő cpitéliális sejtek sejtosztódását és laktációját is stimulálja in vitro. Ezek szerint a találmány szerinti peptidek in vivo is hatnak különböző szarvasmarhasejtek, így például az emlő epitéliális és a szatellit izomsejtek sejtosztódására, és in vivo stimulálják a preformált emlő epitéliális sejteket tcjtcrmelési rátájuk növelésére. A találmány szerinti peptidek hatékonynak mutatkoznak továbbá egyéb állatok (például juh, kecske és sertés, csirke, pulyka, kacsa és más baromfi) izomtömegének és/vagy hús/zsír aranyának növelésére, és más állatok (például juh, kecske, sertés) tejkiválasztásának fokozására, ha ezen állatfajok IGF-II-i és a bIGF-II között elég nagy a homológia. Ivarérett állatokban az izomrostok (például az izomsejtek) száma állandó, így az izomtömeg növekedése kizárólag az izomsejtek hipertiófiájának és a szatellit izomsejlek sokszorozódásának eredménye. Az izomrostok a méhben az osztódó embrionális izomsejtek fúziójával keletkeznek. Az ivarérett állatban található osztódóképes izomsejtek az ún. szatellit izomsejtek. A szatellit izomsejteket azután osztódásra lehet késztetni, és ennek következtében a már létező izomrostokkal fuzionálnak, így növelve az izomrostban található sejtmagok számát. A sejtmagok számának ilyetén növekedése várhatólag önmagában is elengedő az izom tartalom (tömeg) fokozására. Az IGF aktivitásnak az L6 mioblaszt sejtosztódási vizsgálat megbízható in vitro indikátora, és az embrionális mioblasztokra, illetve a felnőtt szatellit izomsejtjeire ható tényezők vizsgálati modelljéül szolgál. Azok a faktorok, melyek e vizsgálatban aktívak, hasonló módon viselkednek a szarvasmarha mioblaszt elsődleges tenyé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
