202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
I » A Dull és munkatársai által leírt hIGF-II A és B régiók alapján két szintetikus oligomert terveztünk, melyeket a továbbiakban IGF-II A-nak illetve IGF-II B-nek jelölünk, és a 2. ábrán (lásd fentebb) mutatunk be. Ezeket az (lásd 2. ábra) oligomereket az Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) DNS Synthesizer Model 380 A vagy B készülékeinek felhasználásával szintetizáljuk. Az oligomereket az exonszekvenciákat tartalmazó genomiális klón kis méretű szubklónjainak azonosítására, az IGF-II B-t pedig DNS szekvenálást szolgáló printerként (kezdő darabként) használjuk. A szarvasmarhavese DNS genom-blotját Southern módszerének egy módosításával készítjük. E módosítás szerint 20 |ig szarvasmarhavese DNS-t emésztünk Eco- RI, BamHI vagy HindlII enzimekkel, 20 x 13,5 cm-es 0,7%-os agaróz gélen frakcionáljuk, etidium-bromiddal (1 pg/ml) festjük, majd fényképezzük. A DNS-t 2 órán át 37 ‘C-on 0,5 n NaOH/1,5 mól NaCl-ban denaturáljuk, majd további 2 órán át 37 *C-on 0,5 mól trisz-HCl (pH= = 8)/l,5 mól NaCl-ban neutralizáljuk, ezt követően egy éjszakán át átvisszük Schleicher és Schnell nitrocellulóz szűrőre 10 x SSPE-vel (az 1 x SSPE 180 mM NaCl-ot 10 mM nátrium-foszfátot, pH = 6,8, 1 mM EDTA-t tartalmaz, valamennyi vegyszer a Sigma Chemical Cotól származik). Szivacsot használunk papírvatta helyett. A szűrőket rövid ideig mossuk 10 x SSPE-vel, levegőn megszárítjuk, vákuumban 80 ‘C-on 2-3 órán át hevítjük, majd 1 órán át áztatjuk 5 x SSPE-vel 50 °C-on. 5x-ös végkoncentrációban Denhardt-oldatot adunk (az 1 x Denhardt-oldat 0,02% polivinil-pirrolidont tartalmaz (valamennyi vegyszer a Sigma Chemical Co-tól származik), és a szűrőket további egy órán át áztatjuk. A biottokat egy éjszakán át 37 ‘C-on előhibridizáljuk 25 ml 50%-os formamidot, 5 x SSPE-t, 5 x Denhardt-oldatot, 0,1 x SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát), és 100 pg/ml karrier lazac (ST) DNS-t, továbbá élesztő tRNS-t tartalmazó elegyben. Az STDNS-t és a tRNS-t 10 perces forralással denaturáljuk, mielőtt az elegyhez adjuk. A próbákat hasadás-vándorlási (nick-translation) módszerrel (Maniatis, 109.oldal) radioaktív izotópokkal jelöljük, 107 - 108 dpm/pg specifikus aktivitásig. 107 - 3 x 10s dpm közötti mennyiségben adjuk a megfelelő nick-transzlált próbát az előhibridizációs elegyhez, melyet azután 48 órán át 42 *C-on inkubáltunk. A szűrőket kétszer mossuk, 15 percig, 42 *C-on 1 x SSPE/0,10% SDS-ben, majd újra mossuk 10-15 percig, ugyanezen a hőmérsékleten, 0,1 x SSPE/0,1% SDS-ben. Levegőn megszárítjuk a szűrőket, és Kodak XAR filmmel -70 *C-on 2-3 napig exponáljuk, egyszeri érzékenységnövelő szűrővel. A 340 bp és 515 bp méretű nick-transzlált próbákkal (1. ábra) végzett szarvasmarha genomiális Southemanalízis eredményeit az V. táblázatban közöljük. 21 HU V táblázat 340 bp-os próba 515 bp-os próba A csík mérete (kbp) EcoRI 4,4 4,4 BamHI 6,0 8,2 Hindin 13,5 13,5 Valamennyi hidridizálódó csík méretének meghatározásakor, illetve az ugyanezen a gélen elektroforctizált, ismert méretű standard DNS gél tetejétől mért futási távolságot hasonlítjuk össze. Az eredmények azt jelzik, hogy a bIGF-II-t teljes egészében kódoló szekvencia egy 4,4 kbp méretű EcoRI fragmensen található. Körülbelül ilyen méretű EcoRI fragmenseket tartalmazó génbankot a következőképpen állítunk elő: a szarvasmarhavese DNS-t teljesen megemésztjük EcoRI enzimmel, majd méret szerint frakcionáljuk agaróz gélelektroforézissel, amint azt fentebb leírtuk. A 3,8 kbp - 4,8 kbp méretű DNS fragmenseket kivágjuk a gélből és elektroelúcióval tisztítjuk (Maniatis, 164. oldal), majd elutip oszlopon kromatografáljuk (Schleicher és Schnell). Az így, méret szerint válogatott DNS 100 ngját ligájuk gtlO lambda vektorba (Vektor Cloning Systems, San Diego, CA). Ezt a vektort EcoRI enzimmel vágott, 0-7 kbp méretű DNS fragmensek klónozására fejlesztették ki. EcoRI-gyel előre vágva és ligádéra kész alakban szerezhető be. A ligációt standard körülmények (Maniatis, 286. oldal) mellett végezzük. A kapott, ligáit DNS-t in vitro pakoljuk a Vector Cloning Systems pakoló extraktumát használva. A kapott génbank ti tere 1,5 x 107 plakk-képző egység (pfu)/pg ligáit DNS. A bank átvizsgálását a következőképpen végeztük: 1,2 x 105 plakk-képző egységet szélesztünk C600 sejtekre, ahogy azt a Maniatis leírásában (320. oldal) megadja. A fágokat 4000 plakk-képző egység/100 cm2 lemezsűrűségben szélesztjük NZC-agarra (az NZC 10% NZ amint, 0,5% NaCl-et, 0,2% MgCl2-ot és 0,1 % kazaminsavat tartalmaz, valamennyi vegyszert a Sigma Chemical Co-tól szereztük be. A lemezeket egy éjszakán át 37 ”C-on inkubáljuk, néhány órán át 4 ‘C-on hűtjük, majd nitrocellulózra visszük át a tarfoltokat, Maniatis leírása szerint (320. oldal). A 340 bp és az 515 bp méretű nick-transzlált próbákkal való hibridizációt úgy végezzük, ahogyan azt a fentiekben a Southern genomiális biottoknál leírtuk. A pozitív kiónokat kiválogatjuk, és az előzővel lényegében azonos második átvizsgálásnak vetjük alá, de a fágsűrűséget 100-200 plakk-képző egység/100 cm2 lemezfelületértékre csökkentjük. A második átvizsgálásban pozitívnak bizonyult kiónokat harmadszor is szélesztjük úgy, ahogy azt már leírtuk, de a fágsűrűséget tovább csökkentjük 20-50 plakk-képző egység/100 cm2-es lemezfelület-értékig. A harmadik átvizsgálás jól elkülönült, pozitív kiónjait kiválogatjuk és ezekből a plakkokból tisztított DNS-t állítunk elő Maniatis leírása szerint (76. oldal). Az inszerteket kivágjuk a lambda gtlO vektor karjai közül EcoRI emésztéssel, majd pUC18 vektorba (New England Biolabs) szubklónozzuk: így az inszert DNS nagy mennyiségének előállítására alkalmas plazmidhoz jutunk. A plazmid DNS-t Maniatis leírása szerint állítjuk elő (90. oldal). Hogy olyan méretű, exon szekvenciákat tartalmazó DNS fragmenseket állítsunk elő, melyek alkalmasak DNS szekvenálásra (kevesebb mint 500 bp), a következő eljárást alkalmazzuk: az inszert DNS-t Alul, HaelII, PstI vagy Sau3A restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Az emésztések során szekvenálható hosszúságú random DNS fragmenseket kapunk. Minden megemésztett mintát véletlenszerűen ligálunk az M13Mpl8 582 B 22 202 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
