202580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Rous Sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására rekombinációs DNS-technikával
7 HU 202 580 A 8 1. példa Veszünk 6 pg pSRA2 DNS-t és egymást követő lépésekben Xmal, Xhol és 7*5/1 restrikciós enzimekkel kezeljük. Minden emésztés után agaróz gélelektroforézissel ellenőrizzük a vágás hatékonyságát. 2 pJ pUC9 DNS-t 7*5/1 és Sail enzimekkel emésztjük a fenti módon. Mindkét DNS-t etanolos kicsapás és háromszori 70%-os etanolos mosás után 20-20 pl ligáló pufferben oldjuk (Maniatis és mtsai, 1982). 20 ng vágott pUC9 és 1350 ng vágott pSRA2) DNS-t összekeverünk, kiegészítjük az előírt komponensekkel (Maniatis és mtsai, 1982), 10 egység ligázt adunk a reakcióelegyhez és éjszakán át 8 ’C-os jégszekrényben tartjuk. A ligátum elegyével (5-10 pl) kakium-kloridos módszenei kompetenssé tett E. coli HB 101 baktériumtörzset transzformálunk (Maniatis és mtsai, 1982) és a sejteket LB táptalajjal készített, 0,5% glukózzal és 20pl/ml ampiciUinnel kiegészített agar-lcmezre szélesztjük. 18 órás inkubálás után (37 *C) a kinőtt telepeket a bennük lévő plazmid méretére analizáljuk (Maniatis és mtsai, 1982). Kiválasztjuk azokat a baktériumtörzseket, melyek a várt, mintegy 5,5 kb méretű plazmidot tartalmazzák. Ezeket a sejteket glukóz és ampicillint tartalmazó folyékony táptalajban szaporítjuk és plazmidot izolálunk (Maniatis és mtsai, 1982). A plazmidot restrikciós endonukleázokkal (7*5/1, Sail, Bam HI, Hind HI), illetve ezek kombinációival ellenőrizzük (Maniatis és mtsai, 1982), és összevetjük az eredeti térképpel (DeLorbe és mtsai, 1980). A kiválasztott kiónt enzim tesztelésre használjuk az alábbiak szerint Az éjszakán át glukózzal és ampiciUinnel kiegészített LB-táptalajban nőtt kultúra 2 pl-ét 20 ml friss fenti táptalajba inokuláljuk és intenzív rázás mellett E«» = 1,0 denzitásig inkubáljuk 37 *C hőmérsékleten. Ekkor vízben frissen feloldott EPTG-t adunk a tenyészethez ImM koncentrációig és folytatjuk az inkubációt további 60 percig. A centrifugálissal összegyűjtött sejteket lizozimmel kezeljük (Maniatis és mtsai, 1982) és lizáló oldattal a szferoplasztokat roncsoljuk (1. Anyagok és Módszerek). A10000 g szupematanst használjuk közvetlenül enzimtesztelésre. Az ellenőrzött és reverz transzkriptázt termelő kiónt preparatív méretben szaporítjuk és indukáljuk, a kultúrából az enzim jellemzése céljából a produktumot izoláljuk. 2. példa A réven transzkriptáz preparatív izolálása 800 ml pMF 14 plazmidot tartalmazó E. coli HB 101 kultúrát glukózzal (0,5%) és ampicillinnal (100 pg/ml) adalékolt LB táptalajban növesztünk, 2,2 denzitás értékig. Centrifugálás után a sejteket 50 ml glukózmentes (ampiciUint tartalmazó) M9 táptalajban szuszpendáljuk és erőteljes rázással 30 perc inkubálás után 10 mM-ig IPTG-t adunk, majd az inkubálást további, 1,5 órán keresztül folytatjuk. A centrifugálással összegyűjtött sejteket folyékony levegőben lefagyasztjuk és -20 *C- on feldolgozásig tároljuk. Az enzimpreparálás minden lépése 4 "C-on történik. A lefagyasztott sejteket szuszpendáljuk 8 ml 10 mM Na-foszfátot (pH 8,0) tartalmazó 10% szacharóz oldatban, majd 2 ml 20 mg/ml-es lizozim oldatot adunk hozzá (a fenti pufferben oldva). 10 perc múlva 11 ml lizáló oldatot rétegezünk rá és két réteget óvatosan összekeverjük. A kapott oldatot 1 órán keresztül 100 000 g-vel centrifugáljuk és a felül úszóhoz 0,1M végkoncentrációig 5M NaCl oldatot adunk (példánkban 43,5 ml felülúszóhoz 870 pl 5M NaCl-t) és ezt az oldatot egy A-pufferrel ekvilibrált 2x12 cm-es DE32 oszlopra felvisszük. A reverz transzkriptáz ß-alegys6ge nem kötődik meg az oszlopon, viszont a DNS polimeráz jelentős része, továbbá a következő kromatográfiát zavaró nukleinsavak igen. Az oszlopot addig mossuk az A pufferrel, míg a meg nem kötött anyag teljesen lejön (az eluátum extinkciója Aao < 0,1) és az átfolyt oldatot (140 ml) 3x4 <kán át dializáljuk 3 x 1 liter B-pufferrel szemben. Az anyagot a dialízis után 2 x 20 cm-es foszfocellulőz (Pll) oszlopra visszük fel. Az oszlopot Aj« < 0,1 extinkcióig mossuk B-puffeirel (példánkban 200 ml-rel), majd az oszlopot 0-1,0 M gradienssel eluáljuk (B pufferben), 4 ml-es frakciókat gyűjtünk. A frakciókból 3 pl-t tesztelünk és a 0,25-0,33 M között lejövő reverz transzkriptáz aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, majd 3x8 órát dializáljuk 3x21 C-pufferrel szemben. A dialízis után az anyagot 0,6 x 6 cm-es Heparin-Sepharose oszlopra visszük, lemossuk a C-pufferrel a meg nem kötött anyagot és az enzimet az oszlopról 0,0- 1,0 M KC1 tartalmú C oldattal eluáljuk. 0,6 ml-es frakciókat gyűjtünk, melyek 2 pl-ében teszteljük a reverz transzkriptáz aktivitását. Az aktív frakciókat (kb. 2,0 ml) D-pufferrel szemben dializáljuk 18 órán át Az enzim összes mennyisége a tisztítás és koncentrálás után mintegy 10 000 E (800 ml kiinduló baktériumkultúrából). A csúcsfrakció az összes enzim aktivitásnak körülbelül egyharmad részét tartalmazza. A koncentrálást követően ennek aktivitása 20-25 U/pl. A kapott enzim jellemzői a következők: A preparátum a standard reakcióelegyben minimálisan 2 órán keresztül képes volt a cDNS-t szintetizálni, szemben a kontrollként használt Boehringer enzimmel (RT Lot No: 10396024-25/Oct. 86), amely 20 perc inkubálásidő alatt több cDNS-t szintetizált, mint 1 óra alatt Ez az adat, valamint az, hogy a mi preparátumunkkal 4 órán keresztül inkubált RNS gélképe nem változott (4. ábra), azt igazolja, hogy a tisztított rekombináns reverz transzkriptáz - szemben egy sor vírusból izolált, kereskedelmi forgalomban kapható reverz transzkriptáz preparátummal - mentes a nem specifikus nukleázoktól. A rekombináns reverz transzkriptáz mind Mg**, mind pedig Mn** ionok jelenlétében képes az rA/dT,3 primertemplát rendszerben poli dT szintézisre. A fenti ionok optimális koncentrációja 3 illetve 2 mM. Valamivel alacsonyabb reakciósebesség mérhető 6 mM Mg** vagy Mn** jelenlétében. Az enzim, szemben a DNS polimerázzal, poli tCn/oligo dG primer-templát rendszerben is működik, de csak Mn** jelenlétében. Ezen a szubsztráton aktivitása mintegy 25%-a a klasszikus poli rA/dT szubsztráton mért aktivitásnak. A fenti rendszerben kapott mérési adatok teljes összhangban vannak az irodalomban más virális 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
