202580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Rous Sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására rekombinációs DNS-technikával
9 HU 202 580 A 10 reverz transzkriptázzal mért adatokkal [Gerard ésmtsai, Biochemistry, 13,1632 (1974)]. PoliA* mRNS-oligo dT primer-templát rendszerben (azaz cDNS szintézisnél) az enzim Mg** optimuma 6mM, Mn** optimuma 2 mM. Ilyen körülmények között 7,5 U enzim 1,5 óra alatt 200 illetve 400 pmol /3H/dTTP-t épít be 0,12 pg mRNS-be, ami megfelel 0,8-1,6 nmol cDNS nukleotid keletkezésének. A keletkező termék mérete poliA* Drosophila mRNS esetében 200-1600 nukleotid, míg a lényegesen hosszabb poliA* patkánymáj hnRNS-t használva 400-7000 nukleotid volt (5. ábra). A példa adatai a kővetkezőket igazolják: 1. A klón által termelt fehérje enzim-aktivitása azonos a virális reverz transzkriptáz aktivitásával. 2. A preparátum mentes minden olyan zavaró szennyezéstől, ami annak molekuláris biológiai felhasználását akadályozná (nukleázok). 3. A rekombináns reverz transzkriptáz képes templát függően átírni a megfelelő primerrel ellátott RNS-t, bármilyen hosszú is az, de legalább 7000 nukleotid hosszúságig, ami jóval hosszabb, mint egy átlagos mRNS. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás Rous sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására, azzal jellemezve, hogy a Rous sarcoma vírus eredetű, pSRA2 plazmidból származó, reverz transzkriptázt kódoló pol gént egy lac promoter mögé, pUC9 plazmidba ligáljuk, a ligátummal E. colit transzformálunk, szelekcióval kiválasztunk egy a virális pol gén represszióját, expresszióját, a mRNS riboszómához kapcsolódását és a transzlációs iniciátor és terminátor szekvenciát egyaránt biztosító szekvencia részleteket tartalamzó rekombinánst, ezzel E. colit transzformálunk, a baktériumsejteket feltárjuk, és a kivont, nyers reverz transzkriptáz enzimet adott esetben tisztítjuk. Elsőbbsége: 1989.09.04. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy E. coliként E. coli HB101 baktériumtörzset használunk. Elsőbbsége: 1989.09.04. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pSRA2 plazmidból származó Pstl és Xhol hasítási helyek közötti virális pol génszakaszt a polilinkerében Pstl és Soll enzimekkel felnyitott pUC9 plazmidba klónozzuk. Elsőbbsége: 1989.09.04. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a tisztítást ioncserélő kromatográfiával végezzük. Elsőbbsége: 1989.09.04. 5 10 15 20 25
