202580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Rous Sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására rekombinációs DNS-technikával
5 HU 202 580 A 6 cDNS kópiát készíti a vírusról illetve bármely RNS-templátról. A következőkben a találmány szerinti eljárást egy példa útján szemléltetjük, anélkül, hogy eljárásunkat a megadott példára kívánnánk korlátozni. A jobb áttekint- 5 hetőség érdekében a példát megelőzően azonban összefoglalva megadjuk az ábrák ismertetését és mindazokat az eszközöket és módszereket, amelyek az eljárás példa szerinti megvalósítása során felhasználásra kerültek. ÁBRAISMERTETÉS Lábra:Az RSV genomot hordozó pSRA2 plazmid vázlatos szerkezete, a klónozás szempontjából fontos hasítási helyek feltüntetésével. H3 = 15 = Hind Hl. [DeLorbe és mtsai, J. Virol 36, 50, (1980) valamint Grandgenett és mtsai, J. Virol. 33,264 (1980) valamint Grandgenett és mtsai, J. Virol. 33, 264 (1980) adatai alapján] 2. ábra: A pUC 9 vázlatos szerkezete 20 3. ábra: a pMF 14 plazmid vázlatos szerkezete H3 = =Hind III; Rí. = EcoRl. 4. ábra: snRNS inkubálása a rekombináns reverz transzkriptázzal 37 ‘C, 4 óra 1 = az RNS preparátum inkubálva 10 E re- 25 verz transzkriptázzal 2 = az RNS preparátum inkubálva reverz transzkriptáz nélkül 3 = az RNS preparátum inkubálás nélkül. 5. ábra: A különböző reverz transzkriptázzal szinted- 30 zált cDNS összehasonlítása 1 = 7,5 E rekombináns reverz transzkriptáz 2 = 12,5 E Boehringer reverz transzkriptáz Drosophila poliA+ mRNS 3 = 7,5 E rekombináns reverz transzkriptáz; poli A+ patkánymáj hnRNS 40 Anyagok A T4 ligáz és a restrikciós endonukleázok a Szovjetunióban gyártott és forgalmazott preparátumokból szár- 45 maztak. Az alkalmazott reagensek és gyanták anilitikai minőségűek, többségükben a Sigma, Merck, Bio-Rad, Pharmacia, Reanal cégek termékei. 50 Módszerek A DNS vágását restrikciós endonukleázokkal az in vitro-rekombinációt, ligálást és baktérium transzformációt az általánosan használt módszerek szerint végeztük 55 (Maniaüs és mtsai korábban idézett közleménye, 1982). Táptalajok és tenyésztések LB: Bacto trypton 10 g 60 Bacto yeast extractum 5 g NaCl 10 g H20 1000 ml-re. Amikor a plazmidot hordozó sejtek tenyésztése volt 65 a cél, mindig kiegészítettük a tápoldatot frissen hígított ampicillinnel, 50-100 pg/ml koncentrációig. Mindazon esetekben, amik«1 a reverz transzkriptáz génje is jelen volt a plazmidban, glukózt is adalékoltunk 0,5% koncentrációig. M9 (u.n. minimal táptalaj): Maniaüs és mtsai, 1982. szerint Az Agár lemezeket (1,5% Bacto-agar) a fend táptalajokkal öntöttük. A tenyésztéseket 37 *C-on végeztük, folyékony táptalajok esetében intenzív rázatással. Plazmid-preparálás 10-20 ml kultúrából az általánosan használt módszer szerint izoláltunk plazmidot (Maniatis és mtsai, 1982). Nagyobb mennyiségű plazmid izolálása esetében [500-1000 ml kultúrából) Norgard szerint járunk el (Norgard, Anal. Biochem. 113, 34, (1981)], amelynek lényege, hogy a baktérium kromoszómális DNS-ének kicentrifugálása után kapott felülúszót tisztítást követően BioGel A 5M oszlopon gélszűrjük, s a plazmidot tartalmazó frakciókat CsCl egyensúlyi sűrűséggrádiensben centrifugáljuk. Gélelektroforézis A DNS mintákat Tris-borát tartalmú 0,7-0,9% agaróz gélben elektroforeüzáltuk (Maniaüs és mtsai, 1982). Oldatok: Lizáló oldat: l%TritonX-100 0,2% NP-40 1 mM EDTA 2 mM DTT 2 mM PMSF 10 mM Na-foszfát, pH 8,0 A-puffer: 10% glicerin 5% szaharóz 0,2% NP-40 10 mM Na-foszfát, pH 8,0 1 mM DTT 0,5 mM EDTA 0,1 mM PMSF 0,1 M NaCl B-puffer: 10% glicerin 0,2% NP-40 10 mM Na-foszfát, pH 8,0 1 mM DTT 0,5 mM EDTA 0,1 mM PMSF C-puffer: 75 mM K-foszfát, pH 7,3 7 mM ß-merkapto-etanol 0,2% NP40 0,1 M EDTA 10% glicerin D-puffer: 50% glicerin 2 mM DTT 1 mM EDTA 0,2% NP 40 200 mM K-foszfát, pH 7,2 4
