202580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Rous Sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására rekombinációs DNS-technikával
3 HU 202 580 A 4 A találmány szerinti eljárásban felhasználható nagy kópiaszámú tekombináns plazmiddal szembeni legfontosabb követelmények a következők:- Erős promotert tartalmazzál, mely- jól indukálható legyen,- tökéletesen represszálható legyen, mert ellenkező esetben a transzformálás során elpusztul a gazdasejt, és végül a klónozó helyet- megfelelő transzlációs fázisba lehessen hozni a pol génnel. Ilyen plazmidok például a következők: pUC-sorozat plazmidjai, pl. pUC7, pUC8, pUC9 stb. [Vieira és Messing, Gene, 19,259 (1982)]. Tac-promotert tartalmazó plazmidok: (DeBoer és munkatársai. In Promoter structure and function ed. L.R. rodrigez and M. J. Chamberlain, Praegar PuN. N. Y. 1982). PL promoter vektorok [Hedgpeth és mtsai, Mol Gen. GeneL 163, 197, (1978)]. Trp E promotert tartalmazó vektorok [Tacan és mtsai, Mol. Gen. GeneL 177, 427, (1980)]. A találmány szerint előnyösen a következőképpen járunk el: A kereskedelemben beszerezhető nagy kópiaszámú pUC 9 (2. ábra) plazmidot polilinkerében Pst I és Sal I enzimekkel felnyitjuk, majd ebbe ligálással beépítjük a fenti vitális pol génnek a Pst I és Xho I hasítási helyek közötti DNS szakaszát A kapott ligátummal £. coli HB 101 baktériumtörzset transzformálunk. Ezután a következőképpen kiválasztjuk a kívánt rekombináns plazmidot hordozó telepeket A telepek lris mennyiségét lizáljuk és a DNS-t agaróz gélben elektroforetizáljuk Eckhardt szerint [Maniaüs és mtsai, a Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)]. Nehézség nélkül kiválaszthatjuk a mintegy 2,8 kb méretű inszertet hordozó rekombináns plazmidot (pMF 14). A kívánt rekombinánst tartalmazó baktériumtörzset oly mértékben szaporítjuk, hogy belőle a térképezéshez elegendő mennyiségű plazmidot preparálhassunk [lásd Maniatis és mtsai fenti közleményét (1982)]. Az Uyen plazmidot különféle restrikciós enzimekkel vágjuk, ellenőrizzük, hogy a kívánt konstrukciót kaptuk-e meg [DeLorbe és mtsai, J. Virol. 36,50, (1980)]. Az elvégzett térképezések alapján láthatjuk, hogy a virális pol gént hordozó pMF 14 konstrukció (3. ábra) rendelkezik mindazon szekvenciarészletekkel, melyek biztosítják a klónozott gén szabályozott átírását, a mRNS riboszómához kapcsolódását, transzlációs iniciátor és terminátor szekvenciát. A klónozott gén expressziójának szabályozó elemei - operátor, promoter, Shine-Dalgamo szekvencia, a transzláció iniciációs tripletje - az E. coli lac operátorból származnak és a pUC9 plazmid komponensei, míg a transzláció stop-kódon ját maga a pol gén szolgáltatja. A géntermék N-terminális vége 25 aminosavból álló pepiiddel egészült ki. Ebből 9 aminosav a vektorból, a többi a pol fehérje természetes kezdetét megelőző szekvenciarészlet átírásából adódik. Az extra pepiid szekvenciája a következő: (ÍMet) Thr Met He Thr Pro Ser Leu Ala Ala Gly Pro Arg Ala Pro Leu Asp Lys Phe Ile Gly Arg Ala Thr Val Leu. A pMF 14 plazmiddal E. coli HB 101 baktériumtörzset transzformálunk. A plazmidot hordozó sejtek a szokásos folyékony és szilárd táptalajokon, például LB-ben, illetve ezzel készített agar-lemezeken, ampicillin jelenlétében nehézség nélkül szaporíthatók. A plazmid és ezzel a klónozott gén stabilitását úgy biztosítjuk, hogy a táptalajon minden esetben tartalmaznak az előírt komponenseken kívül 0,5% glukózt is. A pol gén maximális expressziója IPTG-vel váltható ki. Ekkor a pMF 14 plazmidot hordozó sejteket 0,5% glukózt tartalmazó gazdag folyékony táptalajon szaporítjuk, míg a táptalajból a glükóz illetve metabolitjai elfogynak. Ez többnyire Et« = 2,2 denzitásnál következik be. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és glukózmentes, de a HB 101- es E. coli törzs számára szükséges egyéb komponenseket tartalmazó minimal (M9) táptalajban (Maniatis és mtsai, 1982 - idézett közlemény) szuszpendáljuk, az eredeti térfogat 10%-ában. 30 perc 37 *C végzett inkubálás után 10 mM koncentráció eléréséig IPTG-t adunk, és folytatjuk az inkubációt további 90 percig. A centrifugálissal összegyűjtött biomassza azonnal felhasználható enzim preparálásra, vagy szárazjégben fagyasztva felhasználásig -20 'C-on tárolható. Ezt követi a sejtek feltárása, centrifugálása, ahol az óvatosan leszívott szupematans a kívánt enzimet tartalmazó extraktum. Az extraktumból ioncserélő gyantákon végzett tisztítással és. dialízissel kapjuk meg a tiszta enzimet, amelynek enzim aktivitása a standard reakciókörülmények között meghatározva [(50 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KC1, 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0. 8.pg poli/rA.dT15 és 0,5 mM pH] dTTP 20 pl-ben 37 *C-on 20 percig] 5-20 egység/l pl. 1 1 baktériumkultúrából mintegy 10-20 000 E nyerhető. A találmány szerinti eljárás legfontosabb előnyei a következők: 1. A gyakorlatban legaláltalánosabban a madárvírusból (AMV) preparált enzimet használják, amelyről közismert, hogy a legtökéletesebb cDNS készítésére alkalmas. Szerkezetileg az általunk klónozott ugyancsak madár eredetű RSV reverz transzkriptáz közel áll ehhez az enzimhez. Rekombináns enzimünk korlátlan mennyiségben előállítható magas koncentrációban (>20 U/pl), és az előállítás költségei messze alatta maradnak a hagyományos enzim előállítási költségeinek. 2. Kotewicz és mtsai 1985. továbbá Tanese és mtsai 1985. A Moloney szarkoma vírus (egér) reverz transzkriptáz génjét klónozták, de annak is csak egy részletét Ezzel szemben mi az egész reverz transzkriptázt kódoló génszakaszt klónoztuk. 3. Enzim preparátumunk stabil. 6 hónap alatt aktivitásának legalább 85%-át megtartotta. Ezzel szemben mások a termékük nagyfokú labilitásáról számoltak be [M. J. Roth et. al., J. Bioi. Chem. 260, 9326 (1985)]. 4. Rekombináns enzimünk izolálása nem igényel ionos detergenst (pl. SDS alkalmazása nélkül kvantitave kinyerhető). A denaturáló ágens károsan befolyásolja az enzim minőségét. A mi eljárásunkkal szemben Kotewicz et al. [Gene 35,249 (1985)] az enzim nagyobb hányadát SDS alkalmazásával tudja mobilizálni. 5. Az RSV pol gén klónozása lehetővé teszi, hogy a természetesen virális aß alegységet teljes mértékben rekonstruáljuk géntechnológiai úton. Az utóbbinál bizonyították, hogy az a vírusban előforduló élettanilag aktív forma, amely a legpontosabb 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
