202580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Rous Sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására rekombinációs DNS-technikával
1 HU 202 580 A 2 A találmány tárgya eljárás a Rous sarcoma vírus re ver/, transzkriptázának előállítására rekombinációs DNS- technikával. A reverz transzkriptáz olyan enzim, amely eukariota sejteket megbetegító, egyfonalú RNS genommal rendelkező, úgynevezett retrovírusokban található. A reverz transzkriptáz alapvető jelentőségű az ilyen vírusok életciklusában. Segítségével a vírus egyfonalú RNS genomja kettős láncú DNS-re íródik át. A gyűrűvé záródott kettős láncú vírus-DNS-t a reverz transzkriptáz a gyűrűvé záródás helyén szekvenciaspecifikusan elmetszi, majd a linearizálódott vírus genom beépülhet a gazdasejt genomjába (transzformáció). A reverz transzkriptáz enzim primer- és templátfüggő reakciót katalizál: dezoxiribonukleozid-trifoszfátokból elkészíti a primerrel ellátott egyfonalú RNS DNS komplementerét, majd az így kialakult RNS/DNS hidridből, ugyanennek az enzimnek a közreműködésével, kettős láncú DNS lesz. Abban, hogy a folyamat így végbemegy, a szintetizáló aktivitás mellett közrejátszik az enzim úgynevezett RNáz H aktivitása is, amely a kettős láncú DNS kiépülését megelőzően, leválasztja illetve hidrolizálja a DNS/RNS hidrid RNS komponensét. A különböző fonásokból izolált reverz transzkriptázok molekulatömege eltérő, általában 70 000 és 110 000 dalton közötti érték. Ugyancsak forrásfüggőck az enzim egyéb tulajdonságai. így például, az egerekből izolált retrovírusokból elkülönített reverz transzkriptáz monomer szerkezetű, míg a madár eredetű retrovírusokból kinyert reverz transzkriptáz úgynevezett alegységes enzim, amelynek nagyobb, béta-alegysége proteáz hatásra egy kisebb, alfa-alegységre és egy harmadik proteinre (p32) bomlik szét [Grandgenett és munkatársai, J. Virol. 33, 264, (1980); Schwartz és mtsai, Cell, 22, 853 (1983)]. Közülük a ß2, aß és a komponensek rendelkeznek reverz transzkriptáz aktivitással. A reverz transzkriptáz a molekuláris biológiai kutatások egyik kulcsfontosságú és egyúttal egyik legdrágább enzime. Segítségével gyakorlatilag minden RNS szekvencia DNS szálra írható át (komplementer, azaz cDNS), amely azután alkalmas vektorba klónozható, felszaporítható, szekvenálható, manipulálható stb. Újabban kiteijedten használják egyfonalú DNS „feltöltésére”, továbbá a DNS szekvenáláshoz DNS polimeráz helyett. Az enzim azért költséges, mert a kereskedelemben kapható reverz transzkriptáz enzim preparátumok kivétel nélkül hagyományos módszerrel, vírussal fertőzött sejtekből kiindulva készülnek. A sejtekből első lépésben vírust izolálnak, majd a kapott preparátumból további, hosszadalmas és körülményes tisztítási lépésekkel vonják ki magát az enzimet Nagyobb mennyiségű enzim előállítása ezen az úton nagyon hosszadalmas, munkaigényes és ezáltal költséges. A kereskedelemben például a következő reverz transzkriptáz preparátumok vannak forgalomban: Pharmacia Reverse Transzkriptase, AMV 27-0921-01 200E Boehringer Reverse Transcriptase 109-118 1000 E Amersham Reverse Transcriptase T. 26104 300 E (E = egység) A legutóbbi időben, tudományos vizsgálatok céljra, rekombinációs DNS-technikával is állítottak elő reverz transzkriptázt. Tanese és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 87, 4944 (1985)] illetve Kotewicz és munkatársai [Gene, 35, 249 (1985)] Moloney egér leukémiavírus reverz transzkriptáz génjének (pol gén) kisebb, központi részletét klónozták E. coliban szaporítható expressziós vektorban enzimaktivitást mutató reverz transzkriptáz előállítása céljából. Megfelelő szelekció után a kapott termék enzimaktivitása kielégítő volt ugyan, de a szerzők nem bizonyították, hogy a szintetizált DNS megfelelt-e a templátnak. M. L. Kotewicz szerint még rosszabb eredményre kellene számítani madárfélék retrovírusainak, így a madár myeloblastosis vírusa pol génjénak (AMV) klónozása esetén, elsősorban az ilyen eredetű reverz transzkriptáz enzim alegységes jellege miatt. A natív AMV reverz transzkriptáz szintézise során ugyanis a polimeráz génterméknek egy ß-ß dimert kell alkotnia, amely azután foszforileződik, és egy specifikus helyen az egyik ß-fehérje két alegységre esik szét, az ún. a-alegységre és p32 fehérjére. A fiziológiailag aktív reverz transzkriptáz az a és ß alegységekből álló dimer. Ezek olyan folyamatok, amelyek E. coliban nem katalizáltak. Találmányunk kidolgozása során célunk standard minőségű, a natív, legjobbnak tartott és általánosan használt AMV reverz transzkriptáz tulajdonságait maximálisan megközelítő enzim nagytömegű előállítása volt rekombinációs DNS-technikával. Azt találtuk, hogy - ellentétben azzal, amit a szakirodalom alapján várni lehet - a madárfélékben előforduló Rous sarcoma vírusból származó reverz transzkriptáz gén alkalmasan megválasztott expressziós vektor segítségével E. coliban végzett klónozásával olyan enzim preparátumhoz lehet jutni, amely megfelel a fenti követelménynek. Közelebbről, felismertük, hogy a Rous sarcoma vírusból származó, reverz transzkriptáz kódoló gént [De- Lorbe és munkatársai, J. Virol. 36, 50, (1980)] egy megfelelő, E. coliban szaporítható vektorban klónozva a reverz transzkriptáz enzim nagy mennyiségben termelődik az élő baktériumsejtben, ahonnan szokásos technikákkal elkülöníthető, majd viszonylag egyszerű és olcsó eljárással tisztítható. Találmányunk tárgya tehát eljárás Rous sarcoma vírus reverz transzkriptázának előállítására oly módon, hogy a Rous sarcoma vírus eredetű, pSRA2 plazmádból származó reverz transzkriptázt kódoló pol gént egy E. coli baktériumban szaporítható, tökéletesen represszálható, jól indukálható lac promoter mögé, pUC9 plazmádba ligáljuk, a ligátummal E. colit transzformálunk, szelekcióval kiválasztunk egy virális pol gén represszióját, expresszióját, a mRNS riboszómához kapcsolódását és a transzlációs iniciátor és terminátor szekvenciát egyaránt biztosító szekvencia részleteket tartalmazó rekombinánst A rekombináns plazmáddal E. colit transzformálunk, a baktériumsejteket indukciót követően feltárjuk, és a kivont, nyers reverz transzkriptáz enzimet tisztítjuk. A Rous sarcoma vírus genomja a szekvencia szintjén ismert a következő publikációból [Schwartz és munkatársai, Cell, 32 853 (1983)]. A reverz transzkriptáz enzim génje a Schmidt Ruppin A Rous sarcoma vírus kettősláncú NDS kópiáját (SR A2) hordozó pSRA2 plazmádból származik (lásd DeLorbe és munkatársai fent idézett cikkét). A pSRA2 plazmid szerkezetét az 1. ábra szemlélteti. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
