202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
3 HU 202 577 B 4 Mediátomak a jelátvitelben való alkalmazása számos hátránnyal jár együtt, amilyenek pl. a következők: kiszivárgás lehetősége a biokatalizátort tartalmazó tartományból; az oxidált (és/vagy a redukált) alak diffúziója korlátozott és maga a mediátor természeténél fogva labilis. c) Kategória. Közvetlen elektronátvitel (DET) segítségével működő bioszenzorok Annak a lehetőségét, hogy mediátor alkalmazása nélkül alakítsanak ki bioszenzort, Tarasevich-nek a bioelektrokatalízisre vonatkozó egyik újabb cikke - Bioelectrochemistry 10,231-295,1985 - veti fel. Az ilyen berendezések „reagens nélkülinek” vagy „mediátor nélkülinek” tekinthetők. Tarasevich összefoglalója idéz néhány példát a mediátor nélküli enzim elektródokra, ezek azonban vezetőképes szerves polimereket - pl. a metilviologénhez hasonló szerkezeti egységeket - és/vagy szerves sókat - pl. NMP - TCNG -t (N-metil-fenazinium-tetraciano-4-kino-dimetiletán) - tartalmaznak (ez utóbbiak ugyancsak vezetőképesek), amelyek módosítják az elektród tulajdonságait és betöltik a mediátor szerepét. Ebbe a ketagóriába sorolható számos olyan elektronátviteli módszer is, amely redox fehérjékből történik, módosított elektródok segítségével. Ismeretes, hogy számos vezetőképes szerves polimerre és sóra természeténél fogva instabilitás jellemző, így pl. egy alkoholos bioszenzorban alkalmazott, NMP/TCNG-vel módosított elektród aktivitásának felezési ideje kb. 15 nap. Ezek az elektródok ezenkívül érzékenyek az oxigénre. A nyilvánosságra hozott információk alapján tehát úgy tűnik, hogy eddig még kevés, valóban mediátor nélküli enzim elektródot hoztak létre, bár számos sikertelen kísérletet regisztráltak. Ezek smán többnyire szén alapú elektródokat használtak fel. Újabb, a glukózoxidáz alkalmazására vonatkozó irodalmi adatok (Jonsson és Gorton, az előbbiekben idézett helyen) arra mutatnak, hogy a fő probléma az enzim rögzítésével függ össze; ez ugyanis képes gátolni - szférikus vagy más korlátozások folytán - az elektronátviteli kapacitást és így szükségessé teszi mediátor alkalmazását. Ismeretes néhány ritka példa arra vonatkozóan, hogy nagyon aktív oxidázokat szénen vagy platinán rögzítettek. Ianiello et al. (Anal. Chem. 54,1098-1101,1982) pl. olyan, mediátor nélküli szenzorokat úr le, amelyekben a cianursavkloridos módszerrel glukózoxidázt és L-am inosavoxidázt kötöttek kovalensen egy grafit elektródhoz. Az enzimelektródok működésképes élettartama azonban 20-30 nap (Inaiello és Yacynych, Anal. Chem. 53,2090-2095,1981). Nem közölnek adatot az elektródok oxigén érzékenységére vonatkozóan. A technika állása számos bioszenzort ismertet, amelyek az előbbi elvek alapján működnek (ezek között különösen glukóz szenzorok fordulnak elő), és ezekből egy reprezentatív választék már rendelkezésre áll. A találmány szerinti célok vonatkozásában azonban különösen mérvadónak kell tekinteni az 56-163447 sz. nem vizsgált, közzétett japán szabadalmi bejelentést (Bejelentő: Matsushita Electric Appliance Industry Co.). Ez egy közvetett glukóz elektródot ismertet, azaz olyat, amelyben a glukóz glukózoxidáz jelenlétében történő oxidációja során keletkező hidrogénperoxid: enzim glukóz +02-----> glukonolakton + H202 egy platina elektród felületén oxidálódik: H202—» 2H+ + 2e~ + 02 és az oxidáció során áram keletkezik, amelynek intenzitása arányos a mintában jelenlevő szubsztrátum (glukóz) koncentrációjával. Az elektród lényeges eleme egy elektromosan vezető szénalap, amely egy immobilizált enzim (pl. rögzített glukózoxidáz) réteget hordoz. Az elektromos vezetőképességgel rendelkező alap önmagában öntött grafit, amely kötőanyagként max. 10 tömegrész fluorokarbon gyantát tartalmaz és amelyre - pl. elektrolízis útján vagy gőzlerakódással - vékony (1 (im-nél vékonyabb) - platinafilmet viszünk fel. A találmány segítségével állítólag elkerülhetők az enzimnek közvetlenül a platina felületen való rögzítésével összefüggő problémák és olyan enzimelektród állítható elő, amelyre gyors válasz (5 másodperc), nagy érzékenység és tartósság jellemző. Az ilyen elektródokkal végzett újabb kísérleti munka során azonban ezek az előnyök nem voltak igazolhatók. Ennek megfelelően még mindig szükség van olyan enzimelektródra - különösen, de nem kizárólag glukóz bioszenzorokban való alkalmazásra -, amelyek megbízhatók, reprodukálható eredményeket szolgáltatnak, gyors választ adnak, magas érzékenységűek és hosszú időtartamra vonatkozó stabilitásuk megfelelő. A találmány szerint egy új szénhordozót használunk fel az enzimelektród kiállításához, amely lehetővé teszi, hogy az enzim - pl. a glukózoxidáz - előnyösebb módon kapcsolódjék az elektródhoz. Ez lehetővé teszi a válasz és a stabilitás tekintetében nagymértékben továbbfejlesztett amperometriás szenzor létrehozását Ennek a továbbfejlesztett enzimelektródnak az esetében nincs szükség médiát«' reagens alkalmazására (bár kívánt esetben ez alkalmazható), és azt találtuk, hogy nagyon alacsony oldott oxigén koncentrációk mellett működik. Nagy léptékű válaszreakciókat eredményez: pl. 10 mM töménységű glukóz oldatban, mikroamper/az elektród látszólagos felülete, cm2 dimenzióban kifejezve, százas nagyságrendű áramsűrűségeket eredményez. Úgy látjuk, hogy ez sokkal nagyobb, mint a korábbi amperometriás enzim bioszenzorok esetében és előnyösen használható fel ez a körülmény lmm2-nél kisebb felületű, mikroelemző bioszenzorok előállítására, amelyekkel 0-100 nanoamper érhető el. Az elektród nagyon kis mennyiségű rögzített enzim felhasználásával is előállítható. Glukózra sokkal gyorsabban reagál, mint bármely eddig ismert glukóz szenzor. A reakcióidő tipikus esetben védőmembrán távollétében 1-2 másodperc, membránnal pedig 10-30 másodperc. Különlegesen stabil nedves körülmények között tárolva, még szobahőmérsékleten is. Az elektródok még több hónap múlva is jó választ adnak. Működési tartományuk megnövekedett, és a normálishoz képest lényegesen alacsonyabb üzemi feszültséget igényelnek (325 mV a szokásosabb 650 mV-tal szemben). Az üzemi feszültségen az általuk képviselt háttéiérték feltűnően alacsony. A találmány alapja egy enzimelektród vagy bioszenzor; ez egy elektromosan vezető hordozó elem felületén rögzített enzimből áll. A hordozó gyantával megkötött szén vagy grafit részecskékből álló porózus réteget tartalmaz (vagy egy ilyen réteg alkotja a hordozó elemet). Ezekkel a részecskékkel intenzíven összekeverünk egy finom eloszlású platina-csoportbeli fémet - vagy az említett réteg kialakítására vezető kötés képzése előtt ilyen fémet választunk ki vagy adszorbeáltatunk az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
